Отдел по микробиология и имунология, Държавен университет в Монтана, Бозман, Монтана, Съединени щати, Институт по екосистеми в Монтана, Държавен университет в Монтана, Бозман, Монтана, Съединени американски щати

бактериални

Отдел за принадлежност на венерически болести; Центрове за контрол и профилактика на заболяванията, Форт Колинс, Колорадо, Съединени американски щати

Отдел за принадлежност на венерически болести; Центрове за контрол и профилактика на заболяванията, Форт Колинс, Колорадо, Съединени американски щати

Отдел за принадлежност на венерически болести; Центрове за контрол и профилактика на заболяванията, Форт Колинс, Колорадо, Съединени американски щати

Отделение за принадлежност към преносима по вектори болест; Центрове за контрол и профилактика на заболяванията, Форт Колинс, Колорадо, Съединени американски щати

Отдел за принадлежност на венерически болести; Центрове за контрол и профилактика на заболяванията, Форт Колинс, Колорадо, Съединени американски щати

  • Райън Томас Джоунс,
  • Джеф Борхърт,
  • Ребека Айзен,
  • Катрин Макмилан,
  • Карън Боглер,
  • Кенет Л. Гейдж

Фигури

Резюме

Цитат: Jones RT, Borchert J, Eisen R, MacMillan K, Boegler K, Gage KL (2015) Асоциирани с бълхи бактериални общности в екологичен трансект в ендемичен регион на чума в Уганда. PLoS ONE 10 (10): e0141057. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141057

Редактор: Микаел Скурник, Университет в Хелзинки, ФИНЛАНДИЯ

Получено: 28 май 2015 г .; Прието: 1 октомври 2015 г .; Публикувано: 20 октомври 2015 г.

Това е статия с отворен достъп, без никакви авторски права, и може да бъде възпроизвеждана, разпространявана, предавана, модифицирана, надграждана или използвана по друг начин от всеки за каквато и да е законна цел. Произведението е предоставено на базата на Creative Commons CC0, посветена на публичното достояние

Наличност на данни: Данните за ДНК последователността са депозирани в GenBank и номерата за присъединяване са включени в документа. Картографските файлове, OTU таблицата и Fasta файловете се качват като поддържаща информация.

Финансиране: Финансирането беше осигурено от Центровете за контрол и превенция на заболяванията.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

От 2000 г. повече от 95% от съобщените случаи на човешка чума са се случили в Африка на юг от Сахара [1]. Модели, включващи 10-годишни метеорологични данни и данни за честотата на човешката чума, установиха, че в Уганда рискът от чума се увеличава в места, разположени над 1300 метра височина и с увеличени (но не непрекъснати) дъждове през февруари, октомври и ноември [2]. В допълнение, броят на случаите на човешка чума в региона на Западен Нил е отрицателно свързан с валежите от сухия сезон и положително с валежите през интервалния дъждовен сезон, който непосредствено предхожда сезона на предаване на чумата [3]. Увеличените валежи могат да увеличат първичното производство, което от своя страна може да увеличи изобилието от гризачи и бълхи [2,4,5]. Предвижда се увеличаването на изобилието от бълхи да увеличи риска от епизоотично събитие на чума [6].

В допълнение към изобилието от бълхи, асоциираните с бълхи микробни съобщества също могат да допринесат за предаването на чума. Yersinia pestis, причинителят на чумата, намалява изобилието или напълно елиминира специфични бактериални линии в рамките на бълхите [7], а излагането на лабораторно отгледани бълхи на различни микробни съобщества от див тип увеличава предаването на Y. pestis [8]. Въпреки че определянето на присъствието на определени родове (напр. Rickettsia spp., Bartonella spp., Yersinia pestis) при диви бълхи е рутинно, характеризирането на цели бактериални съобщества от диви бълхи е ограничено [9,10]. Не е установено, че микробният състав на две тясно свързани бълхи (Oropsylla hirsuta срещу Oropsylla tuberculata cynomuris) и на две по-отдалечени бълхи (Orchopeas leucopus срещу Ctenophthalmus pseudagyrtes) [9,10]. Въпреки това, асоциираните с бълхи бактериални съобщества се изместиха драстично за три години и при двата изследвани вида бълхи [10]. Промените в микробните съобщества с течение на времето често се дължат на съпътстващи промени в условията на околната среда [11–15], но условията на околната среда преди това не са били изследвани по отношение на свързаните с насекоми бактериални съобщества.

Симбионтите на вектори на болестта могат да посредничат за разпространението на болестта чрез отрицателни или положителни взаимодействия с патогени. Wolbachia-положителните комари са потиснали нивата на инфекция от вируса на денга, вируса Chikungunya, вируса на Западен Нил и Plasmodium spp. [16–18], и въвеждането на Wolbachia-позитивни комари в естествена популация се оказа ефективно средство за намаляване на броя на потенциалните преносители на човешките заболявания [19]. Целият микробиом, свързан с насекоми, също може да повлияе на устойчивостта на патогена; титрите на вируса на денга в стерилни средни черва на Aedes aegypti са значително по-високи от титрите в A. aegypti с микробиоми от див тип [20]. Изглежда, че тези отрицателни ефекти на микроби, свързани с вектор, върху патогени не се проявяват между бактерии, свързани с бълхи, и Y. pestis: излагането на „без микроби“ бълхи на микроби от див тип увеличава предаването на Y. pestis [8] и заразяването на диви бълхи (с микробиоми от див тип) с Y. pestis елиминира специфични бактериални линии в рамките на бълхите [7]. Бълхоносните вируси тепърва предстои да бъдат проучени, но взаимодействията между вируси и Y. pestis могат също да променят способността на бълхите да предават Y. pestis и би било ново изследователско занимание в бъдеще.

В това проучване ние характеризирахме бактериалните съобщества на шест вида бълхи, събрани от девет вида гризачи през март 2011 г. от десет места в ендемичен от чума район на Уганда. За двата най-разпространени вида бълхи, ние анализирахме допълнителни проби, събрани през октомври и декември 2010 г. Благодарение на нашата стратегия за вземане на проби, можем да тестваме за ефектите на гостоприемник на гризачи, видове бълхи, място, условия на околната среда и време върху свързаните с бълхи бактерии общности.

Материали и методи

Проби от бълхи

Бълхите се съхраняват в 70% етанол при събиране. Преди екстракцията на ДНК, отделни бълхи се стерилизират на повърхността чрез накисване в 10% белина за 30 секунди и след това се измиват два пъти със 100% етанол. Повърхностно стерилизираните бълхи бяха подложени на 20 минути механичен лизис с помощта на хомогенизатор Retsch MM301 и след това ДНК беше извлечена с помощта на MO BIO PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit (Carlsbad, CA) със стандартен протокол.

ДНК секвениране

Амплифицирахме V1 и V2 хипервариабилните области на 16S рРНК гена, използвайки описаните по-рано праймери: праймерът (5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') съдържа 16S rRNA ген 27f праймер, 454 Life Sciences праймер В последователност и дву- базов линкер „TC“; обратният праймер (5′-GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNNNCATGC TGCCTCCCGTAGGAGT-3 ′) съдържа 12 bp коригиращ грешки баркод, 16S rRNA гена 338r праймер, Life Sciences праймер A последователност и двубазов ‘CA’ линкер [22]. Амплифицирахме ДНК пробите, като използвахме следните условия: Първоначална денатурация при 94 ° С за 5 минути; след това 35 цикъла от 94 ° C за 45s, 50 ° C за 30s, 72 ° C за 90s; с окончателно удължаване при 72 ° С за 10 минути. Всяко усилване беше извършено в три екземпляра и PCR продуктите от трите независими реакции бяха комбинирани и почистени с помощта на MO BIO UltraClean-htp 96 Well PCR Clean-Up Kit (Carlsbad, CA). Концентрацията на всяка проба беше изчислена с помощта на Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA). Нормализирани и почистени PCR продукти с маркер, комбинирани в една проба и изпратени до EnGenCore (Columbia, SC) за ДНК секвениране на Roche Genome Sequencer FLX с използване на титаниеви реагенти.

Анализ на последователността

Анализирахме данните за ДНК последователността, използвайки QIIME v1.8 [23]. Последователностите бяха присвоени на тяхната проба от бълхи въз основа на уникални баркодове и бяха филтрирани с помощта на настройките за качество по подразбиране на QIIME. Поредиците бяха съкратени до 280 базови двойки и бяха избрани оперативни таксономични единици (OTU), използвайки алгоритъма за изключване и праг на сходство от 97% [24]. Най-разпространената последователност в рамките на OTU беше избрана като негова представителна последователност и представителните последователности бяха подравнени с помощта на PyNAST [25]. Изравнените последователности бяха филтрирани срещу подравняването на ядрото на greengenes и скринирани за химери с помощта на ChimeraSlayer и химерните последователности бяха премахнати от набора от данни. ДНК последователностите, представляващи по-малко от 0,005% от всички последователности, бяха премахнати от набора от данни. Пробите от бълхи с по-малко от 300 ДНК последователности бяха премахнати от набора от данни. Крайният набор от данни включва 660 345 ДНК последователности от 332 бълхи (диапазон: 305–4279 ДНК последователности на бълха). Тези ДНК последователности са свързани в 421 OTU (Accession #: KT589425 –KT589833). Присвоихме таксономични класификации на OTU въз основа на базата данни RDP, както е приложено в рамките на QIIME. Оценихме филогения на OTU, използвайки FastTree [26].

Алфа разнообразие

Алфа разнообразието е мярка за разнообразие в местен мащаб [27]; тук се отнася до количеството бактериално разнообразие, открито в рамките на отделна бълха. Използвахме проби от бълхи, представени от поне 1000 ДНК последователности (n = 282), за да оценим алфа разнообразието. Разредихме набора от данни до 1000 (т.е. 1000 ДНК последователности бяха избрани на случаен принцип от всяка проба от бълхи). От този разреден набор от данни алфа-разнообразието беше оценено по два начина, използвайки QIIME v1.8: наблюдавани видове и филоразнообразие. Наблюдаваните видове е просто броят на уникалните OTU, представени във всяка проба. Филоразнообразието е метрика на филогенетичното алфа разнообразие и представлява сумата от дължини на клонове, представени от една общност, дадена филогенетично дърво, изградено с използване на всички потенциални членове на общността [28].

Бета разнообразие

Резултати

Общо 660 345 ДНК последователности бяха групирани в 421 OTU въз основа на 97% сходство на последователността. По-голямата част от бактериите в рамките на шестте вида бълхи принадлежат към четири бактериални тила: Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria (Фиг. 1). В рамките на C. calceatus cabirus вид Spiroplasma също е често срещан (Таблица 3).

Протеобактериите бяха допълнително разделени въз основа на Клас: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria. Ccc: Ctenophthalmus calceatus cabirus, Dl: Dinopsyllus lypusus, St: Stivalius torvus, Xb: Xenopsylla brasiliensis, Xc: Xenopsylla cheopis, Xn: Xenopsylla nubica. Xenopsylla nubica не са секс.

От откритите 421 OTU само 12 представляват средно поне 1% от бактериите, открити във всички видове бълхи (Таблица 3). Най-често срещаната и широко разпространена OTU е линия от рода Bartonella, а следващите четири най-често срещани линии са тези, свързани с известни ендосимбионти (напр. Wolbachia, Cardinium). Освен най-често срещаната линия на Bartonella и най-често срещаната линия на Wolbachia, повечето от често срещаните линии обикновено са доминиращи членове на общността в рамките на един вид бълхи, но редки членове на общността в други видове бълхи. Три линии в рамките на Pasteurellaceae са били много в един вид, но редки или липсват в други видове (Таблица 3).

Наблюдаваният брой на OTU в рамките на бълхи варира от средно 8,1 при женските S. torvus до 36,9 средно при мъжките X. cheopis (фиг. 2А). Жените са имали значително по-малко наблюдавани OTU, отколкото мъжете при D. lypusus, S. torvus и X. cheopis. Филоразнообразието варира средно от 1,36% при женските S. torvus до 4,65% средно при мъжките X. cheopis (фиг. 2Б). Жените са имали значително по-малко филоразнообразие от мъжете при D. lypusus, S. torvus, X. brasiliensis и X. cheopis.

Алфа разнообразието беше измерено като общия брой на наблюдаваните OTUs, открити в подгрупа от 1000 произволно избрани последователности от проба (A) и като филоразнообразие от бактерии в проба (B). Разнообразието не се различава значително между мъжете и жените от C. c. кабирус и пол не е определен за X. nubica. Броят на наблюдаваните видове не се различава значително при X. brasiliensis. Във всички други сравнения мъжките бълхи са имали значително по-голямо разнообразие въз основа на t-тестовете на учениците. Ccc: Ctenophthalmus calceatus cabirus, Dl: Dinopsyllus lypusus, St: Stivalius torvus, Xb: Xenopsylla brasiliensis, Xc: Xenopsylla cheopis, Xn: Xenopsylla nubica.

Видовете бълхи имаха голям и значителен ефект върху бактериалната общност (Фигура 3; Таблица 4); площадка, гостоприемник на гризачи и височина (над 1300 м срещу 1300 м) също варира значително със състава на общността, когато всички проби са анализирани едновременно (Таблица 4). Ефектите от гостоприемника, мястото, датата на събиране и пола върху бактериалните съобщества в рамките на видовете бълхи варират в зависимост от видовете бълхи, анализирания фактор и показателя, използван за сравняване на общностите (Таблица 5). Ефектът от пола е широко разпространен сред различни видове бълхи, при мъже и жени, които имат различни бактериални съобщества в D. lypusus (само UniFrac), S. torvus, X. brasiliensis и X. cheopis. Хостът, мястото и датата на събиране също са засегнали значително бактериалните съобщества при видовете Xenopsylla, в зависимост от метриката, използвана за сравняване на общностите (Таблица 5).

PCoA се извършва въз основа на различията между Bray-Curtis (A) и на претеглените разстояния UniFrac (B). Процентът на вариация, обяснен с оси 1 и 2, е представен в скоби. Зелено: Ctenophthalmus calceatus cabirus, Лилаво: Dinopsyllus lypusus, Жълто: Stivalius torvus, Синьо: Xenopsylla brasiliensis, Червено: Xenopsylla cheopis, Оранжево: Xenopsylla nubica.

Височина, средногодишни валежи и средна месечна температура значително се променят със състава на бактериалната общност във всички проби (Таблица 6). В рамките на X. cheopis бактериалните съобщества се променят с надморска височина, средногодишни валежи и средна месечна температура; в рамките на X. brasiliensis, бактериалните съобщества варират със средните месечни валежи (Таблица 6).

Дискусия

Бактериалните линии в Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria доминираха в общността на шестте вида бълхи, изследвани в това проучване (Фигура 1). Многократно е доказано, че същите тези бактериални доминират в бактериалните съобщества в предишни проучвания на бълхи [9,10], други вектори на болести [9,32–35], голямо разнообразие от насекоми [36–38] и животни като цяло [ 39–41]. Нищо не си струва, че нито една двойка праймери няма да открие всички бактерии и че изборът на праймери винаги ще повлияе на откриването на бактериални линии, но анализираният тук регион има ниски нива на непокриване за повечето видове (изключения включват Aquificae, Armatimonadetes, Chlamydiae, Planctomycetes и Verrucomicrobia; тези линии не са често срещани членове на асоциирани с насекоми бактериални съобщества) [42].

Много от най-често срещаните родословни линии са свързани с известни симбионти, открити по-рано при бълхи (напр. Bartonella spp. [43–45], Cardinium sp. [46], Wolbachia spp. [44,47–49], Spiroplasma spp. [46, 50,51], Lariskella sp. [52]). Въпреки това, някои линии, често откривани в това проучване, не са свързани с известни симбионти на насекоми. Три от най-често срещаните линии са били от семейство Pasteurellaceae и са били разпространени в рамките на един вид бълхи, но са редки или не съществуват при други видове бълхи (Таблица 3). Този модел предполага специфична за вида симбиоза между видовете бълхи и съответната линия Pasteurellaceae. Въпреки че това е често срещано при някои групи бактерии (напр. Rickettsiales, Bacteroidetes), тази специфична за видовете връзка не е била наблюдавана по-рано в Pasteurellaceae. Откритите тук линии Pasteurellaceae споделят само 90–95% сходство на последователността с други по-рано секвенирани бактерии, което предполага, че откритите тук линии представляват нови линии на свързани с насекоми бактериални симбионти.

Видовете бълхи са имали най-голям ефект върху състава на бактериалната общност (Таблица 4; Фигура 3). Това подкрепя предишна работа, която демонстрира значителен ефект от таксономията на гостоприемника на насекоми върху състава на бактериалната общност [36,37]. Нашите резултати обаче се различават от предишни изследвания на бактериални съобщества, свързани с бълхи, които не откриха разлики в бактериалните съобщества между видовете бълхи [9,10]. Тук Wolbachia spp. и Bartonella spp. са били често срещани при различни видове бълхи, но всеки вид бълхи е имал и уникален бактериален род (Таблица 3). Тези линии, уникални за специфични видове бълхи, вероятно са отговорни за ефекта на видовете бълхи върху състава на общността (Таблица 4).

Доколкото ни е известно, това е първото проучване за оценка на въздействието върху околната среда върху свързаните с насекоми бактериални съобщества. Успяхме да сравним асоциираните с бълхи бактериални съобщества с променливите на околната среда като температура, валежи и надморска височина (Таблица 6). Надморска височина, средногодишни валежи и средна месечна температура, всички варираха значително със състава на бактериалната общност при използване на всички проби от бълхи (Таблица 6). Това е резултат, донякъде обусловен от неслучайно разпределение на видове бълхи по места (Таблица 1) и силния ефект на видовете бълхи върху състава на бактериалната общност (Таблица 4). Независимо от това, значителни ефекти от надморската височина, средните годишни валежи и температурата също се откриват в X. cheopis, което предполага, че въздействието върху околната среда може да допринесе за състава на бактериалната общност. Ефектите върху околната среда обаче са доста слаби и това е донякъде изненадващо, тъй като огнищата на Y. pestis често се дължат на промените в околната среда [3,5,53–55].