Потенциално зависимо оцветяване на митохондриите в клетките на E. magnusii, издигнати във фазата на логаритмичен растеж от JC1 (A), Rh123 (B). (D, E) - клетките бяха отгледани в логаритмичен (D) и късен стационарен стадии (E) и белязани с 0,3 μM DAPI за ДНК. A, B - клетките се инкубират с 0.5 μM JC1 или Rh123 в продължение на 20 минути. Инкубационната среда съдържа 0,01 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), 1% глицерол, рН 7,4. Областите с висока митохондриална поляризация са обозначени с ярко-жълта (A), ярко-червена (B) флуоресценция поради концентрираното багрило. За изследване на препаратите, оцветени с Rh123, бяха използвани филтри 02, 15 (Zeiss) (увеличение 100 ×). Снимките са направени с помощта на камера AxioCam MRc. С - ултраструктура на клетките на E. magnusii след 30 минути инкубация. N - ядро, Mito - митохондрии, V - вакуола. (C) —ултраструктура на клетките E.magnusii. N - ядра, V - вакуоли, Mito - митохондрии.

Криви на растеж на дрождите E. magnusii (A) и клетъчния енергиен статус (B) върху глицерол- и глюкозосъдържаща среда. (А) - абсорбцията се оценява на всеки два часа в клетъчна суспензия при дължина на вълната 590 nm (A590) с помощта на спектрофотометъра. Представените данни са средните стойности на три независими култивирания (със сравними резултати), всеки в три екземпляра със стандартното отклонение. (B) - микроизображения на дрождите E. magnusii във фазата на логаритмичен растеж в глицерол - (а) и глюкоза - (б) - съдържаща среда. (B), (c - h) - потенциално зависимо оцветяване на клетките на E. magnusii, отгледани в различните фази на растеж с Rh123. Клетките се инкубират с 0,5 цМ Rh123 и се изследват след 0, 15, 20 и 30 минути. Инкубационната среда съдържа 0,01 М буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS), 1% глицерол или 1% глюкоза, рН 7,4. Областите на висока митохондриална поляризация са яркочервени поради концентрирана боя. (Ba, c, e, g) - съдържаща глицерол среда; (Bb, d, f, h) - съдържаща глюкоза среда. (c, d) - логаритмична фаза; (д, е) —96 часа растеж; (g, h) —168 h растеж. За изследване на препаратите, оцветени с Rh123, бяха използвани филтри с 02, 15 (Zeiss) (увеличение × 100). Снимките са направени с помощта на камера AxioCam MRc.

Оцеляването на дрождите, отглеждани в среда, съдържаща глицерол и глюкоза (A). Резултатите са представени като средни стойности ± SEM (n = 4). * Разликите между клетките, използващи глюкоза и използващите глицерол, са статистически значими (p B - E) - микроизображения на дрождите E. magnusii при 96 (B, C) и 168 (D, E) часа растеж на глицерол - (C, E) и глюкоза- (B, D) -съдържаща среда. За жизнеспособност на клетките, дрождените клетки от различни фази на растеж бяха центрофугирани, измити със стерилна вода. Дрожжевите клетки се суспендират в PBS и 200 uL проба от клетъчната суспензия се смесва със 100 uL метиленово синьо и се инкубира в продължение на 5 минути при стайна температура. Жизнеспособността беше изследвана под светлинен микроскоп, използвайки камерата на Gorjaev (× 400) от най-малко 1000 клетки в един биологичен реплика. Жизнеспособните клетки бяха безцветни, а мъртвите бяха сини. (b - e) - Анализи за разреждане на петна в YPD среда, съдържащи глюкоза (b, d) или глицерол (c, e) (2 µL на петно) за дрождите E. magnusii, отгледани при 96 (b, c) и 168 (d, д) часове на растеж.

Оцеляването на дрождите, отглеждани в среда, съдържаща глицерол и глюкоза (A). Резултатите са представени като средни стойности ± SEM (n = 4). * Разликите между клетките, използващи глюкоза и използващите глицерол, са статистически значими (p B - E) - микроизображения на дрождите E. magnusii при 96 (B, C) и 168 (D, E) часа растеж на глицерол - (C, E) и глюкоза- (B, D) -съдържаща среда. За жизнеспособност на клетките, дрождените клетки от различни фази на растеж бяха центрофугирани, измити със стерилна вода. Дрожжевите клетки се суспендират в PBS и 200 uL проба от клетъчната суспензия се смесва със 100 uL метиленово синьо и се инкубира в продължение на 5 минути при стайна температура. Жизнеспособността беше изследвана под светлинен микроскоп, използвайки камерата на Gorjaev (× 400) от най-малко 1000 клетки в един биологичен реплика. Жизнеспособните клетки бяха безцветни, а мъртвите бяха сини. (b - e) - Анализи за разреждане на петна в YPD среда, съдържащи глюкоза (b, d) или глицерол (c, e) (2 µL на петно) за дрождите E. magnusii, отгледани при 96 (b, c) и 168 (d, д) часове на растеж.

Оценки на общите клетъчни диенови конюгати (DCs) и нивата на реактивни кислородни видове (ROS) в глицерол - (A) и глюкоза - (B), асимилиращи дрожди E. magnusii, отгледани на различни етапи на растеж. Динамиката на вътреклетъчното производство на ROS се наблюдава с помощта на спектроскопска флуоресцентна сонда на дихидро-2 ', 7'-дихлорофлуоресцеин диацетатен естер H2DCF-DA. Общо клетъчните DC се екстрахират чрез смес от хептан и изопропил и се центрофугират при 4000 х g за 10 минути. Супернатантът се смесва с малко вода, хептановата фаза се разтваря в етанол. Спектрите на сканиране на ултравиолетово поглъщане между 220 и 300 nm бяха измерени с помощта на спектрофотометъра Beckman DU-8 с появата на максимума в областта 232-234 nm и рамото в областта 260-280 nm. За изчисляване на DC се използва коефициент на моларна екстинкция от 2,2 × 105 × M -1 × s -1 cm -1. Инкубационната среда за експериментите съдържа 50 mM KPi, рН 5,5; и 1% глюкоза. Стойностите са средни ± S.E.M от 5-6 независими експеримента. Интензивността на производството на ROS във версията на «положителен контрол» възлиза на 234195,83 интензивност на флуоресценция, единици. a, b, c - 0,05> p> 0,005.

Резюме

метаболитно

Потенциално зависимо оцветяване на митохондриите в клетките на E. magnusii, издигнати във фазата на логаритмичен растеж от JC1 (A), Rh123 (B). (D, E) - клетките бяха отгледани в логаритмичен (D) и късен стационарен стадии (E) и белязани с 0,3 μM DAPI за ДНК. A, B - клетките се инкубират с 0.5 μM JC1 или Rh123 в продължение на 20 минути. Инкубационната среда съдържа 0,01 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), 1% глицерол, рН 7,4. Областите с висока митохондриална поляризация са обозначени с ярко-жълта (A), ярко-червена (B) флуоресценция поради концентрираното багрило. За изследване на препаратите, оцветени с Rh123, бяха използвани филтри 02, 15 (Zeiss) (увеличение 100 ×). Снимките са направени с помощта на камера AxioCam MRc. С - ултраструктура на клетките на E. magnusii след 30 минути инкубация. N - ядро, Mito - митохондрии, V - вакуола. (C) —ултраструктура на клетките E.magnusii. N - ядра, V - вакуоли, Mito - митохондрии.

Криви на растеж на дрождите E. magnusii (A) и клетъчния енергиен статус (B) върху глицерол- и глюкозосъдържаща среда. (А) - абсорбцията се оценява на всеки два часа в клетъчна суспензия при дължина на вълната 590 nm (A590) с помощта на спектрофотометъра. Представените данни са средните стойности на три независими култивирания (със сравними резултати), всеки в три екземпляра със стандартното отклонение. (B) - микроизображения на дрождите E. magnusii във фазата на логаритмичен растеж в глицерол - (а) и глюкоза - (б) - съдържаща среда. (B), (c - h) - потенциално зависимо оцветяване на клетките на E. magnusii, отгледани в различните фази на растеж с Rh123. Клетките се инкубират с 0,5 цМ Rh123 и се изследват след 0, 15, 20 и 30 минути. Инкубационната среда съдържа 0,01 М буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS), 1% глицерол или 1% глюкоза, рН 7,4. Областите на висока митохондриална поляризация са яркочервени поради концентрирана боя. (Ba, c, e, g) - съдържаща глицерол среда; (Bb, d, f, h) - съдържаща глюкоза среда. (c, d) - логаритмична фаза; (д, е) —96 часа растеж; (g, h) —168 h растеж. За изследване на препаратите, оцветени с Rh123, бяха използвани филтри с 02, 15 (Zeiss) (увеличение × 100). Снимките са направени с помощта на камера AxioCam MRc.

Оцеляването на дрождите, отглеждани в среда, съдържаща глицерол и глюкоза (A). Резултатите са представени като средни стойности ± SEM (n = 4). * Разликите между клетките, използващи глюкоза и използващите глицерол, са статистически значими (p B - E) - микроизображения на дрождите E. magnusii при 96 (B, C) и 168 (D, E) часа растеж на глицерол - (C, E) и глюкоза- (B, D) -съдържаща среда. За жизнеспособност на клетките, дрождените клетки от различни фази на растеж бяха центрофугирани, измити със стерилна вода. Дрожжевите клетки се суспендират в PBS и 200 uL проба от клетъчната суспензия се смесва със 100 uL метиленово синьо и се инкубира в продължение на 5 минути при стайна температура. Жизнеспособността беше изследвана под светлинен микроскоп, използвайки камерата на Gorjaev (× 400) от най-малко 1000 клетки в един биологичен реплика. Жизнеспособните клетки бяха безцветни, а мъртвите бяха сини. (b - e) - Анализи за разреждане на петна в YPD среда, съдържащи глюкоза (b, d) или глицерол (c, e) (2 µL на петно) за дрождите E. magnusii, отгледани при 96 (b, c) и 168 (d, д) часове на растеж.

Оцеляването на дрождите, отглеждани в среда, съдържаща глицерол и глюкоза (A). Резултатите са представени като средни стойности ± SEM (n = 4). * Разликите между клетките, използващи глюкоза и използващите глицерол, са статистически значими (p B - E) - микроизображения на дрождите E. magnusii при 96 (B, C) и 168 (D, E) часа растеж на глицерол - (C, E) и глюкоза- (B, D) -съдържаща среда. За жизнеспособност на клетките, дрождените клетки от различни фази на растеж бяха центрофугирани, измити със стерилна вода. Дрожжевите клетки се суспендират в PBS и 200 uL проба от клетъчната суспензия се смесва със 100 uL метиленово синьо и се инкубира в продължение на 5 минути при стайна температура. Жизнеспособността беше изследвана под светлинен микроскоп, използвайки камерата на Gorjaev (× 400) от най-малко 1000 клетки в един биологичен реплика. Жизнеспособните клетки бяха безцветни, а мъртвите бяха сини. (b - e) - Анализи за разреждане на петна в YPD среда, съдържащи глюкоза (b, d) или глицерол (c, e) (2 µL на петно) за дрождите E. magnusii, отгледани при 96 (b, c) и 168 (d, д) часове на растеж.