Леандро Фрейре дос Сантос

1 Федерален университет в Парана, Департамент по биопроцеси и биотехнологии - Usina piloto B, Куритиба - PR - Бразилия

Розалия Рубел

2 Клинична болница UFPR, Бразилия

Сандро Хосе Рибейро Бонато

3 Институт „Пеле Пекено Принсипи“, Бразилия

Ана Лусия Заната

4 Катедра по физиология, Федерален университет в Парана, Бразилия

Юлия Айкава

4 Катедра по физиология, Федерален университет в Парана, Бразилия

Адриана Ая Ямагучи

4 Катедра по физиология, Федерален университет в Парана, Бразилия

Мария Фернанда Торес

5 Катедра по анатомия, Федерален университет в Парана, Бразилия

Vanete Thomaz Soccol

1 Федерален университет в Парана, Департамент по биопроцеси и биотехнологии - Usina piloto B, Куритиба - PR - Бразилия

6 магистърска програма по индустриални биотехнологии, Университет Позитиво, Бразилия

Саша Хабу

7 Федерален технологичен университет в Парана - Военен инженерен институт, Бразилия

Карин Браун Прадо

8 Катедра по патология, Федерален университет в Парана, Бразилия

Карлос Рикардо Сокол

1 Федерален университет в Парана, Департамент по биопроцеси и биотехнологии - Usina piloto B, Куритиба - PR - Бразилия

Резюме

Това проучване изследва ефекта от добавката на биомаса Cordyceps sinensis, получена от потопена ферментация върху липидите в кръвта и ниския тестостерон, предизвикана от диета с високо съдържание на мазнини (HFD). Експериментите са проведени с използване на дългосрочен прием на HFD и HFD плюс Simvastatin или C. sinensis (4 месеца). Нашите резултати показват, че холестеролът в плазмата, триглицеридите и LDL са намалени чрез добавяне на биомаса на Cordyceps sinensis (CSBS). Дългосрочният прием на HFD причинява значително увреждане на черния дроб, което е възстановено от CSBS. CSBS нормализира намаляващите нива на тестостерон, наблюдавани при диетични плъхове с високо съдържание на мазнини. Всички тези открития ни карат да предполагаме, че C. sinensis е успял да намали концентрацията на липиди в кръвта, да увеличи хепатопротективната активност и да нормализира нивата на тестостерон.

Въведение

Биологичните свойства на мицела на C. sinensis, включително противовъзпалителни и противотуморни активности, са били изследвани преди това (Liu et al., 2011 [18]; Yan et al., 2011 [33]).

Интересното е, че в допълнение към мицеловите си ефекти, получени от ферментация в твърдо състояние, биомасата на C. sinensis, получена от потопена ферментация (Chimilovski et al., 2011 [7]), може да бъде ефективно средство в липидния метаболизъм. Тази хипотеза се подкрепя от някои доказателства за глюкан, изолиран от C. sinensis (Wu et al., 2005 [32], 2007 [31]). Забележително е, че хипохолестеролемичните ефекти на глюканите са показани в различни проучвания (Tiwari and Cummins, 2011 [26]; Lei et al., 2012 [16]). По същия начин потопената ферментация е конвенционален подход за получаване на висококачествена биомаса и тази техника притежава конкретни предимства като превъзходство в контрола на процесите и лесно възстановяване на биомасата (Sun and Xu, 2009 [24]).

Текущият интерес към ефекта на глюканите върху основния метаболизъм на липидите е съсредоточен върху възможността глюканите да заловят жлъчните киселини в червата и по този начин да увеличат изключването на жлъчните киселини в изпражненията (Bowles et al., 1996 [3]). Второ, приемането на холестерол може да бъде инхибирано от глюкан в чревната стена (Drozdowski et al., 2010 [10]). Трето, глюканите се подлагат на процес на ферментация, за да произведат късоверижни мастни киселини, които могат да инхибират синтеза на холестерол (Drozdowski et al., 2010 [10]; Turunen et al., 2011 [27]).

Атеросклерозата, сложното взаимодействие на макрофагите със серумния холестерол в артериалната стена, е водещата причина за сърдечно-съдови заболявания в световен мащаб и се превърна в сериозен социален проблем. Сред различните фактори, водещи до атеросклероза, липопротеиновият холестерол с висока плътност, триглицеридите и общият холестерол се считат за основните рискови фактори в неговата патогенеза (Østerud и Bjørklid, 2003 [20]; Ding et al., 2012 [8]; Zha et al., 2012 [35]).

Тъй като повишените параметри на холестерола и други липиди могат да повлияят на развитието на атеросклероза и натрупването на холестерол в коронарните артерии (Zha et al., 2012 [35]), ние предположихме, че хиполипидемичната активност трябва да бъде изследвана в биомасата на C. sinensis, получена от потопена ферментация.

Демонстрирани са съвременни познания относно ролята на хроничното чернодробно заболяване върху нивата на тестостерон. Проучванията показват, че ниските нива на тестостерон са често срещани при мъже с тежко чернодробно заболяване (Grossmann et al., 2012 [12]). Патогенезата на ниските нива на тестостерон при мъже с хронично чернодробно заболяване включва дисрегулация на оста хипоталамо-хипофиза-гонада на множество нива (Grossmann et al., 2012 [12]). По този начин тежестта на хроничното чернодробно заболяване може очевидно да се превърне в сериозен проблем за момчетата в пубертетен стадий.

Тук изследвахме дали дългосрочният прием на мазнини може да намали нивата на тестостерон чрез увреждане на черния дроб (причинено от отлагане на мазнини в черния дроб) и благоприятните ефекти на CSBS, произведени от потопена ферментация, върху модела на хиперлипидемия и ниския тестостерон, наблюдавани при високо тлъсти диетични фуражни плъхове.

Експериментално

Приготвяне на диета

Използваната основна диета за животни (Labina, Purina ®, Сао Пауло, Бразилия) е модифицирана чрез добавяне със следните съставки (g/100 g): свинска мас, 14 и хидрогенирана растителна мазнина, 6. За да я приготвим сме смесили прахообразен стандарт диета и разтопени липиди (свинска мас и хидрогенирани растителни мазнини). Ежедневната средна стойност на приема на храна се определя чрез добавяне на консумираната храна всеки ден от всички плъхове от всяка група и разделянето й с броя на плъховете на група.

Уча дизайн

Всички процедури, включващи животни, бяха одобрени от Позитивския университетски комитет за хуманно отношение към животните. Четиридесет мъжки плъхове Wistar, 30 дни с тегло 110 g (± 10 g) бяха разделени на четири групи (по десет на група). Животните се държат в дома за животни при температура 24 ± 2 ° C с 12/12 часов цикъл светлина/тъмнина в продължение на 4 месеца и се хранят със съответните диети и вода ad libitum. Контролната група е хранена с базална диета без модификация, HDF и HFD + Simvastatin (Medley, Campinas-SP, Бразилия) или C. sinensis групи са били хранени с модифицирана базална диета и модифицирана базална диета + Simvastatin или C. sinensis съответно. При необходимост се добавят биомаса Simvastatin и C. sinensis заедно с модифицирана базална диета. Дозировката на лекарството и биомасата бяха 10,36 mg/Kg и 10% (w/w) (лекарство или биомаса/фураж) за общо 14 седмици съответно.

Биохимични определяния

В края на експериментите животните се анестезират чрез ефирно вдишване и кръвни проби се събират чрез сърдечна пункция за измерване на плазмения холестерол, триглицериди, LDL, AST активност, урея и тестостерон.

Измерванията на плазмените липиди, урея и креатинин бяха извършени в автоматизирана система ADVIA 1650 (Bayer AG, Leverkusen, Германия). Измерванията на тестостерона бяха извършени чрез директен имуноанализ на Roche E170.

Чернодробни липидни хидропероксиди

Дозирането на липидни хидропероксиди се извършва върху метанолов екстракт от чернодробна тъкан, както е описано от Nourooz-Zadeh et al. 1994 г. [19]. Част от 300 mg от десния лоб на черния дроб се хомогенизира в 1 ml метанол, като се използва електрически хомогенизатор (GGS 27, Bosch). След центрофугиране (5000 g, 5 минути, 4 ° C), 50 µL аликвотна част от супернатантата (безклетъчен екстракт) се съхранява за допълнително измерване на общите протеини и 90 µL аликвотни части се разпределят в шест флакона за центрофуги (1, 5 ml). Към три от тези флакони се добавят 10 uL метанолен 10 mM трифенилфосфин, като по този начин се генерират три заготовки. Към останалите три флакона се добавят 10 uL метанол. Всичките шест флакона бяха завихрени и след това инкубирани за 30 минути при стайна температура. След това 900 μL FOX 2 (100 тМ ксиленол оранжев, 4 тМ BHT, 25 тМ сярна киселина и 250 тМ амониев железен сулфат, 90% метанол, 10% ултрачиста вода) бяха добавени към всички флакони. След смесване пробите се инкубират още 30 минути при стайна температура. Абсорбцията се измерва при 560 nm с помощта на спектрофотометър (Ultrospoc 2000, Pharmacia Biotech). Резултатите бяха коригирани за концентрацията на протеина на екстракта.

Общо белтъци в черния дроб

Методът, описан от Брадфорд, е извършен за това измерване (Bradford, 1976 [4]). Накратко, 250 µL реактив на Брадфорд бяха добавени към 10 µL безклетъчен екстракт в микроплака. След 5 минути при стайна температура, абсорбцията при 595 nm беше измерена с помощта на микропланшетен спектрофотометър (Benchmark, Bio-Rad). Концентрацията на протеин беше определена чрез интерполиране на стойностите на абсорбция в стандартна крива, генерирана от известни концентрации на говежди серумен албумин.

Хистопатология и оцветяване

Направихме биопсии на черния дроб на животни от различни експериментални групи: (A) Control, (B) HFD и (C) HFD плюс C. sinensis. Образците за биопсия бяха фиксирани във формалин, вградени в парафин и нарязани в криостат със серийни участъци от 3 до 6 µm след замразяване. След това те бяха оцветени със суданско черно.

Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± SEM стойности. Статистическият анализ беше извършен чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Tukey. Стойността на р (фиг. 1) показва липидните параметри (плазмен холестерол, триглицериди и LDL) на плъхове, хранени с HFD и HFD, допълнени със симвастатин и биомаса (C. sinensis). В експеримента за хранителна добавка нивата на липидните параметри са изчислени с помощта на ензимно-колориметричен метод. Диетични фуражни плъхове с високо съдържание на мазнини показват повишаване на нивата на холестерол в плазмата и LDL; обаче нивата на триглицеридите не показват промени в сравнение с контролните животни. Simvastatim и C. sinensis, прилагани на хранителни плъхове с високо съдържание на мазнини като хранителна добавка, се понасят добре и причиняват положителен отговор (значително намаляване) като плазмен холестерол, триглицериди и LDL нива. Интересното е, че Simvastatin (синтетична хиполипидемия) и C. sinensis показват сходни тенденции.

получена

Нашите диетични условия показват увреждане на черния дроб чрез натрупване на липидни капчици, което може да отразява чернодробната стеатоза (Фигура 2 (Фигура 2)) (Amacher, 2011 [1]). Всички други анализи също показват увреждане на черния дроб, като активност на аспартат аминотрансфераза, плазмена урея и липидна пероксидация (HFD група) (Фигура 3 (Фиг. 3)). От третираните групи плазмената урея не показва подобрени нива. Въпреки че Simvastatin и C. sinensis могат да се считат за биологично неактивни срещу увреждане на черния дроб, когато наблюдаваме плазмените нива на урея (Фигура 3B (Фигура 3)), възможно е периодът на лечение да не е успял да възстанови ензимите на цикъла на урея. Активността на аспартат аминотрансферазата, чернодробните хистопатологични анализи и липидната пероксидация показват, че третираните групи, особено в HFD плюс C. sinensis, проявяват хепатопротективна активност (Фигура 2 (Фигура 2) и Фигури 3А, С (Фигура 3)). За оценка на увреждането на тъканите е предложена оценка на окислителното увреждане от липидното прекисно окисление в тъкан, изложена на оксидативен стрес (Wang et al., 2012 [29]). Съобщава се за корелация между HFD и подобрения оксидативен стрес (Chaudhari et al., 2012 [6]).

Заключения

Нашите резултати показват, че добавянето на биомаса от C. sinensis при хранителни плъхове с високо съдържание на мазнини в продължение на 4 месеца нормализира липидите в кръвта и ниските нива на тестостерон, предизвикани от HFD. Вероятно добавката на биомаса от C. sinensis не може да замени използването на наличните в момента лекарствени режими за намаляване на липидите, но може да ги допълни. Те могат също така да позволят използването на по-ниски дози терапевтични лекарства, като по този начин намаляват риска от странични ефекти, свързани с дозата. Нашите наблюдения също допринасят за валидността на настоящите знания относно ролята, която играе хроничното чернодробно заболяване за по-ниските нива на тестостерон. Трябва да се направят допълнителни проучвания, за да се оценят нивата на IGF, както и други параметри на пубертета, за да се оцени забавеното начало на признаци на пубертетно съзряване.

Бележки

Leandro Freire dos Santos и Carlos Ricardo Soccol (Федерален университет в Парана, Катедра по биопроцеси и биотехнологии - Usina piloto B, Куритиба - PR - Бразилия; [email protected]) допринесоха еднакво като съответни автори.

Благодарности

Авторите благодарят на Националния съвет за научни изследвания (CNPq) и на Координацията за подобряване на персонала - висше ниво (CAPES), Бразилия, за финансова подкрепа и болницата в Клиникас (Федерален университет в Парана - Бразилия), които любезно предоставиха техническата помощ.

Декларация за интерес

Авторите съобщават за липса на декларация за интерес.