Хранене на животните и метаболизъм

Редактиран от
Вероник А. Лакомб

Държавен университет в Оклахома, САЩ

Прегледан от
Мохамед Е. Абд Ел-Хак

Университет Загазиг, Египет

Ф. Капела Е Силва

Departamento de Biologia, Escola de Ciência e Tecnologia, Университет Евора, Португалия

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

гранични

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Отдел по хранене, физиопатология и фармакология (NP3), Oniris, Колеж по ветеринарна медицина, хранителни науки и инженерство, CRNH, Нант, Франция
  • 2 UMR 1280 Физиопатология на хранителните адаптации (PhAN), INRAE, CRNH, Изследователски център за хранене на Западен човек, CHU, Нант, Франция
  • 3 USC 1383 Клетъчна и молекулярна имуноендокринология (IECM), INRAE, Oniris, Колеж по ветеринарна медицина, хранителни науки и инженерство, Нант, Франция
  • 4 Изследователски център, Royal Canin SAS, Aimargues, Франция
  • 5 Стомашно-чревна лаборатория, Тексаски университет A&M, College Station, Тексас, САЩ

Въведение

Въпреки нормалните временни вариации, беше показано, че в дадена среда фекалната микробиота може да се счита за стабилна при кучета (1), както и при други видове (2, 3). Многобройни фактори на околната среда, като диетата, могат временно или постоянно да променят микробиотата. При кучетата чревната микробиота може да бъде изместена както от високо протеинови диети (4–6), така и от вариацията в съотношението протеин към въглехидрати (7, 8). Както при другите видове, ферментиращите фибри също играят роля в чревната микробиота (6, 9-11). И накрая, HFD (12), както и промяната в съотношението мазнини и въглехидрати променят чревната микробиота (13).

Кучешкото затлъстяване е свързано с много метаболитни и хормонални нарушения, като по-ниска инсулинова чувствителност. По-рано показахме, че наддаването на тегло при прехранените кучета е свързано с намалена инсулинова чувствителност, нискостепенно възпаление и променен липиден статус (14, 15). Обратно, загубата на тегло при кучета с наднормено тегло води до подобряване на чувствителността към инсулин, намаляване на провъзпалителните цитокини (16) и подобряване на липидния профил (17).

В тази среда различните физиологични или патологични състояния определят разликите в чревната микробиота. По-специално е показано, че микробиотата на слаби индивиди или животни се различава от тази на затлъстелите. При хората и мишките основната разлика се отнася до увеличаване на съотношението на двете преобладаващи фили при тези видове, Firmicutes и Bacteroidetes (18, 19). В сравнение с постните мишки и независимо от родството, об/об животните имат 50% намаление в изобилието на Bacteroidetes и пропорционално увеличение на Firmicutes (18). При хората относителният дял на Bacteroidetes намалява при затлъстелите хора в сравнение с слабите хора и че този дял се увеличава със загуба на тегло при два вида нискокалорична диета (19). Разликите в чревната микробиота също са описани при затлъстели кучета в сравнение с слаби кучета (12, 20, 21). Хетерогенността на резултатите обаче не позволява да се идентифицира бактериален подпис на затлъстяването при кучета, както е направено при хора и мишки (18, 19). Интересно е също така, че е съобщено също така, че ефектът от диетата върху микробиотата може да бъде повлиян от оценката на телесното състояние на кучето (BCS), използвана като индекс на затлъстяване (5).

Много изследвания предполагат, че чревната микробиота може да участва в развитието на затлъстяване. Сред предложените механизми микробиотата може да увеличи енергийната реколта от диетата, като увеличи усвояването на монозахариди в тънките черва (22) и производството на късоверижни мастни киселини (SCFA) чрез ферментация в задните черва (23). Въпреки това, ролята на SCFA за затлъстяването, както и причините за повишените фекални концентрации на SCFA са противоречиви (24).

Чревната микробиота може също да играе роля за насърчаване на затлъстяването, като предизвиква ендотоксемия, поради системна циркулация на липополизахариди (LPS), съставна част на стените на чревните грам-отрицателни бактерии. Това твърдение се основава на наблюдението, че при мишки хроничната инфузия на LPS предизвиква подобно увеличаване на масата на цялото тяло, черния дроб и мастната тъкан и подобни метаболитни ефекти, по-специално хипергликемия и хиперинсулинемия, на този при HFD (25) . Също така е показано, че HFD може да индуцира увеличаване на чревните LPS-съдържащи бактерии и промяна на чревната бариера чрез механизъм, свързан с намалена експресия на епителни протеини с плътно свързване (26). Както промените в микробиотата, така и в чревната пропускливост могат да доведат до ендотоксемия и да допринесат за развитието на затлъстяване.

В проучвания, които са изследвали последиците от HFD върху чревната микробиота, е било трудно да се разграничат ефектите, задвижвани от увеличения прием на калории от тези, задвижвани от повишеното телесно тегло (и повишените телесни мазнини), тъй като HFD обикновено се прилага в хиперенергичен режим ниво (или дори ad libitum). Също така искахме да изложим хипотезата на Cani et al. (26), според която микробиотата би участвала в намаляването на инсулиновата чувствителност чрез метаболитна ендотоксемия и нискостепенно възпаление, придружено от повишаване на чревната пропускливост. HFD би предизвикал промени в чревната микробиота, участващи в развитието на наддаване на тегло и промени в чревната бариера и метаболитните и възпалителни параметри. Настоящото проучване е предназначено да сравнява ефектите на HFD, хранени при енергийни нужди за поддържане, с тези от същата диета при 150% поддържане върху микробиотата, чревната бариера и физиологията на гостоприемника (възпалителни и метаболитни променливи).

Материали и методи

Животни и жилища

Двадесет и четири здрави женски стерилизирани кучета бигъл (възраст: 5,1 ± 0,4 години, средно ± SEM; BW: 13,2 ± 1,3 kg; BCS: 6/9 (обхват, 5/9–6/9) взеха участие в това проучване. Проба размерът не се изчислява официално. Вместо това включването на 24 кучета се основава на способността на съоръженията на Oniris да гарантират хуманно отношение към животните и да гарантират, че работното натоварване на пробите може да се извършва в надеждни условия от един човек, за да се избегне манипулация.

Кучетата бяха настанени по двойки въз основа на тяхната социална съвместимост, в заграждение на открито, което включваше защитено място за спане (2,0 х 5,0 м). Те имаха ежедневно взаимодействие със своите болногледачи и ежедневен достъп до външни детски площадки. Кучетата се ваксинират ежегодно и се обезпаразитяват на всеки две години. Те бяха обявени за здрави въз основа на клиничен преглед, брой на кръвните клетки и серумна биохимия. Кучетата не са получавали лекарства, които се очаква да променят чревната микробиота (напр. Антибиотици) през предходните 2 месеца.

Кучетата са настанени в ONIRIS, Националното ветеринарно училище в Нант, Франция, съгласно разпоредбите за хуманно отношение към животните на френското министерство за изследвания. Протоколът отговаря на насоките на Европейския съюз за експериментиране с животни (директива 2010/63 относно защитата на животните, използвани за научни цели) и е одобрен както от Комитета за етичен преглед на Royal Canin (090118-03), така и от Комитета по етика на „Pays-de-la -Loire ”(Apafis # 13800).

Диети и учебен дизайн

Преди започване на проучването кучетата са били хранени със стандартна поддържаща диета в продължение на 5 месеца (средно възрастни, Royal Canin, Aimargues, Франция; Таблица 1). По време на проучването всички кучета са получавали хиперлипидна, нормопротеинова търговска суха диета в продължение на 8 седмици (33% мазнини, 29% протеин, 4830 kcalME (метаболизираща енергия)/kg (Marathon 5000 ® Royal Canin, Aimargues, Франция; Таблица 1). Кучета бяха разпределени на случаен принцип в две групи: групата HF-100, която получи диетата при 100% от нуждите за поддръжка на енергия (н = 8; 103 ± 11 kcalME/kgBW 0,75/ден) и групата HF-150, която яде диетата при 150% от необходимостта от енергия за поддръжка (н = 16; 168 ± 26 kcalME/kgBW 0,75/ден). Храната се даваше веднъж на ден и водата беше постоянно достъпна. Количеството диета, необходимо за задоволяване на изискванията за поддръжка, се изчислява от енергията, необходима за поддържане на постоянно тегло през периода преди проучването.

маса 1. Състав на диетата преди проучване и диетата с високо съдържание на мазнини на база на хранене и на енергия.

Дизайнът на изследването е показан на фигура 1. BW и BCS се записват всяка седмица. Кръвни проби се извършват след 24-часов период без хранене и след хранене след тест за предизвикване на фураж, преди и в края на 8-седмичния период. Извършва се биопсия на дебелото черво и се определя смилаемостта на диетата, съгласно същия график. Пропускливостта на дебелото черво се определя на изходно ниво и след 4 и 8 седмици. Пресни фекални проби се събират на изходно ниво, след това на всеки две седмици.

Фигура 1. Експериментален дизайн на изследването. HF-100 съответства на групата кучета, хранени с диета с високо съдържание на мазнини при 100% от нужната енергия за поддръжка, а HF-150 съответства на групата кучета, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, при 150% от нужната енергия за поддръжка. HF-150a и HF-150b са ​​две отделни подгрупи, състоящи се от 8 кучета от групата HF-150.

Смилаемост

Смилаемостта на органичните вещества, суровите протеини и мастните вещества е определена съгласно хранителните насоки на FEDIAF (27).

Тест за предизвикателство за подаване

След 24-часов нехранен период, кучетата са били изложени на тест за предизвикване на фураж. Храната за орално предизвикване е съставена от 3 g/kg BW 0,75 протеин, 3 g/kg BW 0,75 глюкоза, 2,5 g/kg BW 0,75 липиди. Взети са кръвни проби от вратната вена преди и 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 и 360 минути след приложението на захранващото хранене. AlphaTRAK, утвърден преносим кучешки глюкомер (Abbott Animal Health, Abbott Park, IL, USA), беше използван за определяне на концентрацията на глюкоза в кръвта веднага след събирането. Плазмените проби се съхраняват при -80 ° C, докато се извършат анализи.

Тестове за серум и плазма

Лептин (Millipore Corporation, Billerica, MA, САЩ), адипонектин (Wuhan Fine Biotech Co, Wuhan, Китай), грелин (BioVendor, Karasek, Чехия), стомашен инхибиторен полипептид (GIP) и невропептид Y (NPY) (BlueGene Biotech, Шанхай, Китай), концентрациите на С-реактивен протеин (CRP) (Helica, Санта Ана, Калифорния, САЩ), серумен амилоид А (SAA) (Abcam, Cambridge, UK) и концентрации на хаптоглобин (Abcam, Cambridge, UK) са измерени в плазма чрез специфични ензимно свързани имуносорбентни тестове (ELISA) комплекти съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията на инсулин се определя чрез радиоимуноанализ (Insulin IRMA KIT, Beckman Coulter, Nyon, Швейцария). Концентрацията на LPS в плазмата се измерва с анализ на limulus amoebocyte lysate (LAL), използвайки пирохромен хромогенен реагент (Associates of Cape Cod, INC., East Falmouth, MA, USA). Концентрацията на плазмения липополизахариден свързващ протеин (LBP) се изследва с помощта на ELISA комплект (Novatein Biosciences, Woburn, MA, USA). Супероксидната дисмутаза (SOD), глутатионпероксидазата (GPx) и общото антиоксидантно състояние (TAS) бяха изследвани чрез колориметричен метод (Randox, UK). Триглицеридите (TG), общият холестерол, HDL-холестеролът (HDL-C) и неестерифицираните мастни киселини (NEFA) се определят чрез колориметрични анализи (Sobioda, Montbonnot Saint Martin, Франция).

Пропускливост на дебелото черво

Поглъщане на захар и събиране на урина

След 24-часов неохранен период се регистрира BW и кучетата се поставят в индивидуални кошари за събиране. Водата беше постоянно достъпна ad libitum. Два милилитра на kg телесно тегло захарен разтвор (150 mg/ml лактулоза (Mylan Pharma, Saint-Priest, Франция) и 100 mg/ml сукралоза (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA)) се прилагат перорално, както е описано по-рано при кучета (28). Четири часа след прилагането на захари, кучетата са хранени с дневната си дажба. Четиридесет и осемчасовата урина беше събрана и пробите съхранени при -20 ° C за последващ анализ.

Съдържание на захар в урината

Приготвянето на проби от урина се извършва, както е описано по-рано от Hernot et al. с изключение на вътрешния стандарт, тураноза (28). Концентрацията на всяка захар се оценява с техника на газова хроматография-масова спектрометрия (Agilent технологии, Санта Клара, САЩ). Концентрацията на захар в урината и обемът на събраната урина за 48 часа бяха използвани за изчисляване на общото количество на отделените захари. Количеството на всяка захар в урината се изразява като процент от погълнатото количество. Пропускливостта на дебелото черво се изчислява чрез съотношението% лактулоза към% сукралоза (L: S).

Биопсии

След 24-часов период без хранене и два препарата на дебелото черво (ден преди и непосредствено преди колоноскопия) чрез топла клизма с използване на вода, бяха извършени шест биопсии на лигавицата на дебелото черво на животно по време на вземане на проби (0 и 8 седмици) с помощта на фиброскоп, между На 15 и 30 см от ануса, под упойка. Биопсиите на тъканите бяха незабавно замразени незабавно в течен азот и държани при -80 ° C, в очакване на екстракция на РНК тъкан.

Преанестетичните лекарства включват медетомидин (Domitor ®, Elanco, Neuilly sur Seine, Франция) при 15 μg/kgBW и буторфанол (Dolorex ®, MSD Animal Health, Beaucouze, Франция) при 0,2 mg/kg BW и се прилага като IV болус 10 минути преди въвеждането на упойка. Общата анестезия се предизвиква с пропофол (Propovet ®, Axience, Pantin, Франция) при 2 mg/kgBW интравенозно. След оротрахеална интубация се поддържа обща анестезия с изофлуран в кислород. Разтвор на Рингер с лактат (Virbac ®, Франция) се прилага интравенозно при 5 ml/kgBW/h. След приключване на процедурата доставката на анестезия беше прекратена и кислородът беше доставен до екстубация. Атипамезол (Atipam, DECHRA Veterinary Products SAS, Suresnes, Франция) при 75 μg/kgBW се прилага интрамускулно в случай на продължително възстановяване.

Екстракция на РНК и RT-PCR

Общата РНК се екстрахира от тъкан на дебелото черво с помощта на реагент TRIzol ® съгласно инструкциите на производителя (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Франция) и концентрацията му се измерва чрез спектрофотометрия при 260 nm.

Общата РНК се транскрибира обратно в cDNA, използвайки Superscript IV Reverse Transcriptase (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Франция). Допълнителен ДНК разтвор (2,5 μl) се добавя към смес, съдържаща 10 μl Takyon TM MasterMix (Eurogentec, Angers, Франция), 2 μl от всеки грунд (2,5 mM) (смисъл и антисенс) и 3,5 μl ултрачиста вода. PCR в реално време се провежда на система CFX96 Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Последователностите на РНК са получени в базата данни на нуклеотидите на NCBI. Грундовете са проектирани с помощта на програма за въвеждане на Primer 3 (Palo Alto CA, USA) и са представени в Таблица 2. Експресията на GAPDH е използвана като референтна стойност. Експресията на гена се изчислява чрез 2 -ΔΔCt метод (29).

Таблица 2. Sense и antisense грундови последователности.

Анализ на микробиота

На всеки две седмици кучета, които бяха настанени по двойки, бяха разделени през деня, за да идентифицират изпражненията. Фекалните проби се събират веднага след спонтанна дефекация и се замразяват в течен азот и след това се съхраняват при -80 ° C до употреба. Екстракцията на бактериална ДНК от фекални проби се извършва с помощта на наличния в търговската мрежа комплект (PowerSoil ® DNA изолиращ комплект, Mo Bio Laboratories Inc., Quiagen, Карлсбад, Калифорния, САЩ) съгласно инструкциите на производителя.

PCR праймери 515/806 (със специфичен баркод за всяко животно) на 16S рРНК ген V4 променлива област бяха използвани в 30-цикъл PCR с помощта на главния смесителен комплект HotStarTaq Plus (Qiagen, САЩ) при следните условия: 94 ° C за 3 минути, последвани от 30 цикъла от 94 ° С за 30 s, 53 ° C за 40 s и 72 ° C за 1 min, след което се извършва краен етап на удължаване при 72 ° C за 5 min. След амплификация, PCR продуктите се проверяват в 2% агарозен гел, за да се определи успехът на амплификацията. Множество проби бяха събрани заедно в равни пропорции въз основа на техните концентрации на ДНК. Събраните проби се пречистват с помощта на калибрирани мъниста Ampure XP. След това събраният и пречистен PCR продукт се използва за приготвяне на ДНК библиотека на Illumina. Секвенирането беше извършено на MR DNA (www.mrdnalab.com, Shallowater, TX, USA) на MiSeq, следвайки указанията на производителя. Данните за последователността бяха обработени с помощта на MR DNA pipeline pipe (MR DNA, Shallowater, TX, USA). В обобщение, обединени последователности, изчерпани от баркодове, ® (Сан Диего, Калифорния).

Резултати

Кучетата остават здрави по време на проучването. Те изядоха ежедневната си дажба напълно, подкрепена от поддържане на теглото или наддаване на тегло.

След 8 седмици диета, BW и BCS са значително по-високи в групата HF-150 в сравнение с групата HF-100. В групата на HF-150 средната BW се е увеличила със 17,4 ± 6,5% по време на 8-седмичната интервенция и това е свързано с увеличение на BCS (седмица 8: медиана на BCS 7; диапазон 6–7 спрямо седмица 0: медиана на BCS 6; обхват 5–6) (Фигури 2A, B).

Фигура 2. (A) Телесно тегло и (Б) Резултат за телесно състояние (BCS) при кучета, хранени с диета с високо съдържание на мазнини при поддръжка (HF-100; н = 8) и при 150% поддръжка (HF-150; н = 16) през 8 седмици. Данните са средни ± SEM. ****P $ P $ P $$$ P $ P # P $ P $$ P # P ## P $ P $$ P § P # P $ P Ключови думи: диета с високо съдържание на мазнини (HFD), микробиота (микроорганизъм), бариера на дебелото черво, чувствителност към инсулин, куче

Цитиране: Moinard A, Payen C, Ouguerram K, André A, Hernandez J, Drut A, Biourge VC, Suchodolski JS, Flanagan J, Nguyen P и Leray V (2020) Ефекти от диета с високо съдържание на мазнини при две енергийни нива върху фекална микробиота, Колониална бариера и метаболитни параметри при кучета. Отпред. Ветеринар. Sci. 7: 566282. doi: 10.3389/fvets.2020.566282

Получено: 27 май 2020 г .; Приет: 21 август 2020 г .;
Публикувано: 25 септември 2020 г.

Вероник Ан Лакомб, Държавен университет в Оклахома, САЩ

Мохамед Е. Абд Ел-Хак, Университет Загазиг, Египет
Ф. Капела е Силва, Университет Евора, Португалия