Това е статия с отворен достъп, разпространявана при условията на лиценза за нетърговски лиценз Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.0/uk/), който позволява неограничено нетърговско използване, разпространение и възпроизвеждане във всякакъв носител, при условие че оригиналната творба е правилно цитирана.

Резюме

Въведение

Микроваскуларните усложнения на диабета споделят обща патофизиология, която може да бъде обяснена като пряка или непряка последица от хипергликемия-медиирана свръхпродукция на реактивни кислородни видове (ROS). Микроваскуларното влошаване може да се предотврати или чрез инхибиране на натрупването на супероксид, или чрез модулиране на нивата на кръвната глюкоза, а сред няколко микроваскуларни нарушения нефропатията (1,2) може да бъде подобрена чрез антиоксиданти (3,4). Антиоксидантната защита на естествените растения е обещаващо терапевтично лекарство за патологии на свободните радикали (5). Сред безбройните естествени растения е установено, че червеното зеле (Brassica oleracea var capitata) и други зеленчуци Brassica, ендемични за Средиземноморския регион антиоксиданти, антихипергликемични (6–8), противоракови (9–11) и хипохолестеролемични (12) свойства. RC екстрактът също така предотвратява оксидативен стрес, предизвикан в черния дроб и мозъка на животни, изложени на паракват (13) и N-метил-d-аспартат (14).

Основните съставки на RC са изотиоцианатите (глюкозинолат), витамините А, В, С и антоцианините (11,15,16). Установено е, че антоцианините, група от фенолни естествени пигменти, присъстващи в RC, имат най-силната антиоксидантна сила от 150 флавоноиди (17). Нашата цел беше да изследваме RC полярния екстракт за антиоксидантни ензими за извличане и оксидативен стрес в бъбреците на индуцирани от стрептозотоцин диабетни плъхове.

Методи

Химикали

Пресни RC бяха закупени от местния пазар в Al Ain, ОАЕ. Комплекти реагенти за урея и креатинин са закупени от BioMerieux (RCS Lyon, Франция). Тиобарбитурова киселина, редуциран глутатион, 5,5-дитиобис (2-нитробензоена киселина), реагент на Фолин, епинефрин, супероксиддисмутаза (SOD) ензим, H2O2, стрептозотоцин (STZ) и говежди албумин са получени от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, МО, САЩ). Всички други стандартни химикали идват от обикновени търговски доставчици.

Плъхове албиноси

Мъжки плъхове Wistar (130–180 g) са получени от Къщата за животни във Факултета по медицина и здравни науки, Университет на ОАЕ, ОАЕ. Плъховете се поддържат на стандартна диета с гранули и вода от чешмата ad libitum. Те са държани в пластмасови клетки при 12-часов цикъл светлина/тъмнина и стайна температура 22–24 ° C и са били аклиматизирани в околната среда в продължение на 2 седмици преди експерименталната употреба. Процедурите за грижи и използване на изследователски животни в ОАЕ отговарят или надхвърлят всички приложими местни, национални и международни закони и разпоредби.

Приготвяне на екстракт от червено зеле

RC листата се нарязват на малки парченца и се сушат във фурна при 50 ° C. Изсушените растения (800 g) се екстрахират в 8000 ml 70% воден етанол, като се използва ултразвукова обработка с интензитет 70 W/cm2 и честота на трептене при 20 kHz за 5 минути. Доказано е, че използването на метод на ултразвукова екстракция намалява опасността от термично разграждане (18). Ултразвукът също така осигурява по-голямо проникване на разтворител в клетъчните материали чрез кавитация и подобрява освобождаването на клетъчното съдържание в насипната среда (18). Ултразвуковото облъчване беше приложено с помощта на цифров сонификатор Branson 450 (20 kHz, 450 W), оборудван с цилиндрична сонда от титанова сплав (12,70 mm в диаметър). Използването на сухи растения може да бъде ефективно за минимизиране на ензимното разграждане на фонетичните съединения в растителните тъкани. След мацерация през нощта екстрактът се филтрира през марля и етанолът се изпарява при понижено налягане при 50 ° С с помощта на ротационен изпарител. Останалият воден екстракт се изсушава с помощта на лиофилизирана суха система при понижено налягане. Изсушеният екстракт се разтваря в дестилирана вода до концентрация 1 g/ml преди приложение на нормални и диабетични плъхове. Добивът на екстракция за RC е около 15%.

Индукция на експериментален диабет

Диабетът се предизвиква чрез инжектиране на единична интраперитонеална доза STZ (прясно приготвена в 0,01 М цитратен буфер, рН 4,5), както е описано по-горе (19). Контролните плъхове се инжектират само с цитратен буфер. Диабетът е идентифициран чрез полидипсия, полиурия (визуални наблюдения) и измерване на концентрацията на глюкоза в кръвта 72 часа след инжектиране на STZ. Плъхове с ниво на глюкоза на гладно над 200 mg/dl се считат за диабет и са използвани в това проучване.

Експериментални групи

RC екстрактът се разтваря в дестилирана вода и се дава орално чрез сонда в доза от 1 g/kg телесно тегло и обем 5 ml/kg телесно тегло. Дневната доза RC (1 g/kg телесно тегло) се основава на досега показаната ефективност за предотвратяване на оксидативен стрес, предизвикан от друг токсичен агент при животни (14). Недиабетичните контролни плъхове, както и диабетичните плъхове бяха разпределени произволно на две групи, които поглъщаха или носител, или RC екстракти при 1 g/kg телесно тегло/ден, съответно в продължение на 8 седмици. В края на експерименталния период плъховете се упояват с диетилов етер след гладуване в продължение на 12 часа и се събират проби от кръв и бъбреци.

Събиране на проби

Вземане на кръв

За ежедневен анализ на глюкозата се събира капка кръв от опашката. Серумът беше извлечен от кръв, събрана от ретро-орбитален сплит (20), след като плъховете бяха подложени на лека анестезия. Серумната урея и креатининът, определени в пресен серум, са показатели за бъбречната функция.

Колекция от бъбреци

В края на експерименталния период плъховете бяха претеглени и умъртвени. Бъбреците се отстраняват, претеглят и се изчислява съотношението бъбрек/телесно тегло. Данните са изразени като относително тегло на органите на един бъбрек до 100 g от общото телесно тегло. Другият бъбрек беше изрязан и хомогенизиран (1 g/10 ml ледено студен калиев хлорид, 150 mM). След това хомогенатът се използва за определяне на нивата на редуциран глутатион (GSH), продукт на липидна пероксидация (LP) Malondialdehyde (MDA), общи протеини и активност на SOD и каталаза (CAT).

Биохимични анализи

Кръвна захар

Нивото на кръвната глюкоза се определя по метода на глюкозната оксидаза, като се използва едно докосване с основен плюс глюкомер (Lifescane Ltd., Калифорния, САЩ).

Намален глутатион

Съдържанието на GSH в бъбречния хомогенат се определя по метода, описан от Van Dooran et al. (21). Основата на метода за определяне на GSH е реакцията на реагента на Ellman 5,5-дитиобис (2-нитробензоена киселина) (DTNB) с тиолова група на GSH при pH 8,0, за да се получи жълт цвят на 5-тиол-2-нитробензоат анион.

Малондиалдехид

MDA е най-разпространеният индивидуален алдехид, резултат от разграждането на LP в биологичните системи. Използва се като индиректен индекс на LP. Определянето на MDA в биологични материали, както е описано в Uchiyama и Mihara (22), се основава на неговата реакция с тиобарбитурова киселина (TBA) за образуване на розов комплекс с максимум на абсорбция при 535 nm.

Каталазни и супероксиддисмутазни ензими

Активността на SOD ензима в бъбречния хомогенат се определя съгласно метода, описан от Sun и Zigman (23). Този метод се основава на способността на SOD да инхибира автооксидацията на епинефрин при алкално рН до адренохром и други производни, които лесно се наблюдават в близост до UV зона на абсорбционния спектър. CAT активността се определя чрез измерване на експоненциалното изчезване на H2O2 при 240 nm и се изразява като единици/mg протеин, както е описано от Aebi (24).

Общ антиоксидантен капацитет

Общият антиоксидантен капацитет в бъбреците беше оценен с помощта на анализ за намаляване на антиоксидантната сила на железа (FRAP). Анализът FRAP се определя, както е описано от Benzie and Strain (25) и както е разработено в нашата лаборатория. Накратко, FRAP анализът измерва промяната в абсорбцията при 593 nm поради образуването на синьо оцветен железно-трипиридилтриазинов комплекс от безцветна окислена железна форма под действието на електронодоносни антиоксиданти.

Креатинин и урея

Нивата на креатинин и урея се определят в серума съгласно метода, описан съответно от Houot (26) и Fawcett и Scott (27). Анализът се извършва с помощта на комплекти реагенти на BioMerieux. Общото съдържание на протеин в бъбреците беше определено съгласно метода на Лоури и модифицирано от Peterson (28). Абсорбцията се записва с помощта на записващ спектрофотометър Shimadzu UV-160A.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на SPSS версия 10 статистически програми (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Разликите между леченията в рамките на експеримент са анализирани чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA). Значителни разлики между средствата за лечение са определени чрез t-тест на Dunnett. Резултатите са представени като средно ± SEM от пет независими експеримента, освен ако не е посочено друго.

Резултати

Червено зеле Поглъщане Отслабени симптоми на диабет

Интраперитонеалното приложение на STZ (60 mg/kg телесно тегло) индуцира всички характерни симптоми на диабета, като повишен прием на храна и вода (съдейки по количеството храна и вода, консумирани на ден), полиурия (данните не са показани), неуспех тегло (фиг. 1). Тези симптоми са били очевидни през целия експериментален период от 60 дни. След 72 часа STZ инжекции, концентрацията на глюкоза на гладно в кръвта се увеличава в сравнение с контролните плъхове, които не са диабетици (Фиг. 2). Нивата на кръвната захар над 200 mg/dl се считат за диабет. Плъхове с диабет, които ежедневно са поглъщали полярен екстракт от RC (1 g/kg телесно тегло), показват подобрение на диабетичната полиурия, което почти изчезва в края на експерименталния период. Консумацията на храна и вода също намалява, когато плъховете с диабет приемат екстракт от RC. RC екстрактът също съкращава загубата на наддаване на тегло при диабетични плъхове (фиг. 1), както и нивата на кръвната захар (фиг. 2) в края на експерименталния период. Плъхове, които поглъщат екстракт от RC, не показват значителни промени в сравнение с контролните плъхове по нито един от разглежданите параметри.

червено

Промени в телесното тегло при плъхове, които не са погълнали (Контрол) или погълнали екстракт от RC (RC), и индуциран от STZ диабет при плъхове, които не са погълнали (Диабет) или са поели екстракт от RC (Диабет + RC), *** P ↑↑ P ** P ↑↑ P Фиг. 3). При диабетични плъхове повишаването на серумната урея (фиг. 4) и серумните концентрации на креатинин (фиг. 5) показва увреждане на бъбречната функция. Бъбречната нефропатия се подобрява при поглъщане на RC екстракт. Фигура 3 показва, че теглото на бъбреците при диабетични плъхове, които са погълнали екстракт от RC, не се различава от контролните плъхове (P> 0,05). Освен това концентрациите на серумната урея (фиг. 4), както и концентрацията на серумен креатинин (фиг. 5) бяха подобрени с поглъщане на екстракт от RC.

Бъбречен антиоксидантен капацитет. * P Фиг. 8). Междувременно, значителен спад (P Фиг. 9). GSH активността се увеличава (P Фиг. 10). Както ензимните, така и неензимните антиоксиданти бяха подобрени след поглъщане на RC екстракт.

Бъбречна SOD активност. * P ↑ P ↑ P ↑↑↑ P d-аспартат в мозъка на мишки (14). Само RC показва значително възстановени нива на глутатион и предотвратява LP, индуциран от N-метил-d-аспартат в мозъка на мишки в доза от 1 gm/kg телесно тегло. RC полярният екстракт е по-защитен от бялото зеле срещу невронално увреждане, предизвикано от амилоиден протеин (40). Тези данни показват, че защитният капацитет на невронните клетки на RC може да се дължи на високото общо фенолно съдържание и антиоксидантната активност. Сред трите различни култивирани форми на зеле, RC има по-високо съдържание на витамин С (24.38 mg/100 g), dl-α-токоферол (0.261 mg/100 g) и съдържание на фенол (101.30 mg/100 g) в сравнение с бялото и савойското зеле (16), всички от които предпазват от окислителни щети.

RC и всички други годни за консумация растения, принадлежащи към семейство Cruciferae и род Brassica (напр. Броколи и карфиол), съдържат значителни количества изотиоцианати (най-вече под формата на техните предшественици на глюкозинолати), някои от които (напр. Сулфорафан или 4-метилсулфинилбутил изотиоцианат) са много мощни антиоксиданти (11,15,16). Антоцианинът, който е фенолен естествен пигмент, присъстващ в RC, има антиоксидантната сила на 150 флавоноиди (17). Ние съобщаваме, че RC полярният екстракт има значителна антихипергликемична активност, която може поне отчасти да модулира оксидативния стрес, причинен от индуцираните от хипергликемия свободни радикали. Естествените здравни продукти от растителен произход показват обещание за профилактика на хронични заболявания (41).

Ежедневното поглъщане на RC полярен екстракт (1 g/kg телесно тегло) подобрява оксидативния стрес и подобрява диабетната нефропатия. Дозовият отговор на RC за фармакологичните ползи, наблюдавани тук, все още предстои да се определи и е необходимо допълнително проучване, за да се види дали по-висока доза и различни начини на приложение могат да предпазят от диабетна нефропатия.

Признание

Тази работа беше финансово подпомогната от изследователските дейности в Университета на ОАЕ по договор №. 07-04-2-11/04. Нашата благодарност се отдава и на Катедрата по биология на Факултета по природни науки за тяхната помощ и подкрепа. Също така благодарим на г-н Пол ДеБауфър (Университет на Илинойс в Чикаго (UIC), САЩ) за коректурата на ръкописа.