Никол С. Кирхоф

1 Катедра по микробиология, Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон, Съединени американски щати

Моник А.Р. Udell

2 Катедра по наука за животни и пасища, Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон, Съединени американски щати

Томас Дж. Шарптън

1 Катедра по микробиология, Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон, Съединени американски щати

3 Департамент по статистика, Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон, Съединени американски щати

Свързани данни

По отношение на наличността на данни беше предоставена следната информация:

Хранилище на лаборатория Шарптън:

Резюме

Въведение

Към днешна дата няма проучвания за изследване на връзката между чревния микробиом и агресията при кучета, което е първата необходима стъпка към окончателното установяване дали чревният микробиом медиира агресията. Предишната работа сочи към потенциално взаимодействие между микробиома и кучешката агресия. Например диетата е силен модулатор на чревния микробен състав при много животни (David et al., 2013) и специфични диетични компоненти са свързани с агресията, включително диети, които намаляват агресивното поведение при кучета (DeNapoli et al., 2000; Re, Zanoletti И Емануеле, 2008). В допълнение, микробиомът на кучешките черва се свързва с други здравословни състояния като възпалително заболяване на червата и остра диария (Suchodolski et al., 2012), което води до дискомфорт или болка, които също могат да допринесат за раздразнителност или агресия. Тук проведохме проучвателен анализ на фекални проби, произхождащи от малка приютена популация от кучета тип питбул, иззети от организирано борба с кучета, за да определим дали кучешката агресия може да се предвиди въз основа на състава на чревния микробиом.

Материали и методи

Вземане на проби

Етично изявление

За целите на това проучване не са необходими субекти с животни, боравене с животни или специфични взаимодействия с животни. Кучешки фекални проби бяха събрани от развъдници за приюти след естествено депозиране. Събраните преди това данни за поведението от записите на агенцията за хуманно отношение към животните бяха използвани за анализ. Следователно, това проучване беше решено да бъде освободено от институционален преглед на грижите и употребата на животни от комисията по етичен преглед на държавния университет в Орегон.

Екстракция на фекална ДНК и 16S секвениране

ДНК беше извлечена от фекални проби с помощта на изолационния комплект за ДНК на QIAGEN DNeasy® PowerSoil® (QIAGEN, Germantown, MD, САЩ), съгласно инструкциите на производителя, с изключение на допълнителна топлинна инкубация от 10 минути при 65 ° C непосредствено преди стъпката на биене на зърната. Генът 16S rRNA се амплифицира от екстрахираната ДНК с PCR и праймери, предназначени да насочват към V4 региона (Caporaso et al., 2012). Впоследствие ампликоните се определят количествено с помощта на Qubit® HS комплект (Thermo Fisher, Waltham, MA USA) и след това се обединяват и почистват с помощта на UltraClean® PCR комплект за почистване (MO BIO, Carlsbad, CA USA). След това тези почистени ампликони бяха секвенирани на инструмент Illumina MiSeq (v3 химия). Това секвениране генерира 3,31 милиона 150 bp единични четения (средно четене на проба = 78 272).

Биоинформатични и статистически анализи

Приликата между извадките беше визуализирана с помощта на анализ на главните координати (PCoA) въз основа на индекса на различия на Bray-Curtis, използвайки веганския (v2.3-3) пакет в R (v3.2.3). Връзката между пробните ковариати, включително агресията на кучетата и сходството между пробите е количествено определена с функцията envfit във веган пакета. Тестовете на Крускал – Уолис, приложени от пакета монети (версия 1.1-2), бяха използвани за идентифициране на OTU и филотипове, които стратифицират пробите по ковариатни фактори. Филогенетичните кладове, които се асоциират с агресията, бяха идентифицирани чрез сглобяване на филогенизирана референтна 16S последователност чрез FastTree, както е описано по-рано (O'Dwyer, Kembel & Sharpton, 2015), като се използва Claatu за разрешаване на монофилетични кладове, които се запазват при агресивни или неагресивни кучета (FDR Фиг. 1; Фиг. S1; S2). Разделянето между агресивни и неагресивни проби в парцела PCoA беше потвърдено чрез анализи на околната среда (p = 0,0250, R2 = 0,1297) и PERMANOVA (p = 0,0346, R2 = 0,0349). Алтернативните мерки за бета-разнообразие незначително подкрепят тези резултати. Например, използвайки метрика за различие на Брей – Къртис, се открива подобна тенденция (PERMANOVA, p = 0,0957, R 2 = 0,0573). Други ковариати на изследването са тествани за тяхната връзка с фекалния микробен състав. Възрастта на кучетата не се свързва с микробния състав (претеглена UniFrac, PERMANOVA, p = 0,1763, R2 = 0,0652). Обратно, полът на кучетата наистина се свързва с микробния състав, когато се използва непретеглена UniFrac (PERMANOVA, p = 0,0400, R 2 = 0,0652), но не и когато се използва претеглена UniFrac (PERMANOVA, p = 0,1424, R 2 = 0,0582). За разлика от разликите в бета-разнообразието между агресивни и неагресивни кучета, не са открити значителни разлики в алфа-разнообразието въз основа на индекса на Шанън при сравняване на поведенчески групи (p = 0,5258).

специфична

Визуализация на филогенетичните разлики във фекалната микробиота на агресивни (зелени) и неагресивни (лилави) кучета, използвайки анализ на основните координати (PCoA) на изобилието на OTU и претегленото разстояние UniFrac. Разделянето между агресивни и неагресивни проби в парцела PCoA беше потвърдено с анализ на пригодността на околната среда (p = 0,0250, R 2 = 0,1297), който поддържа статуса на агресия като променлива, която разделя микробния състав на пробите. Структурата на микробиома на червата на агресивните и неагресивни кучета също е значително различна с претеглената метрика UniFrac, използваща PERMANOVA (p = 0,0346, R 2 = 0,0349). Елипсите се основават на 95% доверителни интервали и стандартна грешка.

Таблица S2

Включва p-стойности от тестовете на Kruskall-Wallis, q-стойности от множество корекции на теста, таксони, бактериални таксони и величината на разликата, които тези таксонови изобилия от таксони, наблюдавани при агресивни над неагресивни кучета.

Таблица S3

Включва p-стойности от тестове на Kruskal-Wallis, q-стойности от множество корекции на теста, OTU низове за таксономия, OTU идентификационни номера и величината на разликата в OTU изобилието от OTU, наблюдавано при агресивни над неагресивни кучета.

Таблица S4

Включва идентификационни номера на клада, р-стойности от тестовете на Крускал-Уолис, q-стойности от коригирани p-стойности на фалшиво откритие, низове на бактериална таксономия за всяка клада и величината на разликата в изобилието на клада от кладове, наблюдавани при агресивни над не- агресивни кучета.

Фигура S1

Визуализация на филогенетичните различия във фекалната микробиота на агресивни (зелени) и неагресивни (лилави) кучета, използвайки анализ на основните координати (PCoA) на изобилието на OTU и претеглено разстояние UniFrac между основните координати едно и три. Структурата на микробиома на червата на агресивните и неагресивни кучета е значително различна с претеглената метрика UniFrac, използваща PERMANOVA (p = 0,0346, R 2 = 0,0349), която включва всички основни координати. Елипсите се основават на 95% доверителни интервали и стандартна грешка.

Фигура S2

Визуализация на филогенетичните различия във фекалната микробиота на агресивни (зелени) и неагресивни (лилави) кучета, използвайки анализ на основните координати (PCoA) на изобилието на OTU и претеглено разстояние UniFrac между основните координати едно и три. Структурата на микробиома на червата на агресивните и неагресивни кучета е значително различна с претеглената метрика UniFrac, използваща PERMANOVA (p = 0,0346, R 2 = 0,0349), която включва всички основни координати. Елипсите се основават на 95% доверителни интервали и стандартна грешка.

Фигура S3

Това изображение е подобно на фигура 3, с изключение на това, че са подчертани две клади в поддърво на Turicibacter: node1504, което е често срещано и по-разпространено при агресивните кучета, и възел 1573, който е често срещан и неагресивен при кучетата.

Допълнителна информация 1

Благодарности

Благодарим на д-р Памела Рийд за нейните съвети и дискусии относно поведението на кучетата. Също така благодарим на д-р Кристофър А. Галке и д-р Юан Дзян за полезните им коментари.

Отчет за финансиране

Националната научна фондация (грант 1557192) и институционалните фондове на Томас Дж. Шарптън подкрепиха тази работа. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Допълнителна информация и декларации

Авторите заявяват, че няма конкуриращи се интереси.

Никол С. Кирчоф анализира данните, изготвя фигури и/или таблици, създава или преглежда чернови на документа, одобрява окончателния проект.

Моник А.Р. Udell замисля и проектира експериментите, допринася за реагенти/материали/инструменти за анализ, създава или преглежда чернови на хартията, одобрява окончателния проект.

Томас Дж. Шарптън замисли и проектира експериментите, анализира данните, внесе реагенти/материали/инструменти за анализ, подготви фигури и/или таблици, създаде или прегледа чернови на хартията, одобри окончателния проект.

По отношение на отлагането на ДНК последователности беше предоставена следната информация:

Държавен университет на Орегон CGRB, публично хранилище на лабораторията Шарптън:

По отношение на наличността на данни беше предоставена следната информация: