Резюме

Въведение

Сигнализирането на стероидни хормони оказва мощно влияние върху метаболизма на горивата и разпределението на телесните мазнини, а промененото сигнализиране е свързано с много аспекти на метаболитния синдром, включително натрупването на чернодробни мазнини при неалкохолни мастни чернодробни заболявания. Активирането на стероидните рецептори се модулира не само чрез циркулиране на концентрациите на стероиди, но и чрез метаболизма на пререцептора в прицелните тъкани. Например, активирането на рецептора се усилва от ароматаза (за естрогенните рецептори) и 11β-хидроксистероидна дехидрогеназа тип 1 (за глюкокортикоидни рецептори). Тези ензими променят вътреклетъчните стероидни концентрации независимо от циркулиращите концентрации, като по този начин оказват влияние върху метаболитната физиология и заболявания (1–3) и осигуряват терапевтични цели при пациенти с рак на гърдата и диабет тип 2, съответно.

предразполага

Изозимите на 5α-редуктаза (5αR) също регулират клетъчните нива на стероиди (4,5). 5αR тип 2 (5αR2) е силно експресиран в простатата, където усилва андрогенното действие чрез превръщане на тестостерона в по-мощния андроген 5α-дихидротестостерон и се инхибира от финастерид при лечението на простатни заболявания. 5αR тип 1 (5αR1) се експресира в човешкия репродуктивен тракт, но също така силно в черния дроб (5) и на по-ниски нива в мастната тъкан (6,7) и скелетните мускули (8), където метаболизира различни прегнени стероиди, включително андрогени и глюкокортикоиди (9); и се инхибира от неселективния инхибитор на 5αRs, дутастерид (10). 5α-Намаляването допринася значително за изчистването на глюкокортикоидите: кортикостерон при гризачи и кортизол при хора. Мишките с дефицит на 5αR1 имат осем пъти по-бавен клирънс на кортикостерон (11), а при хората 5α-редуцираните глюкокортикоиди включват приблизително една трета до половината от метаболитите на кортизола в урината (12).

Повишена екскреция на 5α-намалени стероиди се наблюдава при затлъстяване, синдром на поликистозните яйчници и неалкохолна мастна чернодробна болест (12-17), докато намалената екскреция се наблюдава при критично заболяване (18). Смята се, че свързаните с това промени в скоростта на изчистване на кортизола влияят върху оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза при тези условия. По-рано демонстрирахме, че мишките с дефицит на 5αR1 натрупват излишен глюкокортикоид в черния дроб и мастната тъкан (11), което може да има преки последици за активирането на глюкокортикоидните рецептори. Неотдавнашен доклад (19) показва, че мишките без 5αR1 са по-склонни към чернодробна стеатоза, но без видими разлики в разпределението на телесните мазнини или чувствителността към инсулин и със защита от хепатоцелуларен карцином; механизмите остават неясни, по-специално независимите роли на метаболизма на глюкокортикоидите и андрогените. Те обаче са важни за изясняване, тъй като констатацията, че дефицитът на 5αR1 влияе неблагоприятно върху метаболизма, се превръща в човешко здраве. Наскоро демонстрирахме, че двойното фармакологично инхибиране на 5αR1 и 5αR2 (но не само на 5αR2) влияе неблагоприятно на метаболизма, причинявайки повишено затлъстяване и инсулинова резистентност (20).

Тук предполагаме, че дефицитът или инхибирането на 5αR в черния дроб води до локално натрупване на глюкокортикоиди, засилено активиране на глюкокортикоидните рецептори и последваща инсулинова резистентност, чернодробна стеатоза и податливост към неалкохолна мастна чернодробна болест. При мишки и плъхове само 5αR1 се експресира в черния дроб, за разлика от хората, при които и двата изозима на 5αRs се експресират (4). При плъховете финастеридът е неселективен инхибитор както на 5αR1, така и на 5αR2 (21). Следователно тествахме нашата хипотеза, използвайки мишки с целево делеция на 5αR1 (22,23) и след фармакологично инхибиране с финастерид при плъхове.

Изследователски дизайн и методи

Химикалите са от Sigma (Poole, UK), освен ако не е посочено друго. Разтворителите бяха дестилирани със стъклена високоефективна течна хроматография (Fisher Scientific, Loughborough, Великобритания). Стероидите са от Steraloids (Newport, RI).

Ембрионите (C57BL6/SvEv/129) с целенасочено разрушаване на 5αR1 (22,23) (лабораторията Джаксън, Бар Харбър, МЕ) бяха получени и кръстосване на потомство на хетерозиготи за генериране на хомозиготни мъжки „див тип“ (WT) и „ нокаут ”(KO) мишки (5αR1-KO мишки). Мъжки затлъстели плъхове Zucker и техните слаби контроли са от Harlan Olac (Bicester, Великобритания). Животните са изследвани съгласно лиценза на Министерството на вътрешните работи на Обединеното кралство със свободен достъп до питейна вода и стандартна чау (7,4% мазнини, 4% захароза; RM1; Special Diet Services, Witham, Великобритания) или експериментални диети. Животните бяха убити (0800–1100 ч) чрез обезглавяване; кръв от багажника беше събрана; и тъканите се дисектират, претеглят се мокро и се замразяват или фиксират във формалин.

Изследвания на метаболитната функция при 5αR1-дефицитни мишки

Повишаването на теглото се наблюдава при мъжки WT и 5αR1-KO мишки, поддържани на чау. Тестове за толерантност към интраперитонеална глюкоза (2 mg/g) (GTT) бяха проведени след 6 часа гладуване с кървене от опашката (на 0, 15, 30, 60 и 90 минути).

Отговори на храненето с високо съдържание на мазнини

За хранене с високо съдържание на мазнини, мъжки WT и 5αR1-KO мишки на възраст ∼5 месеца са настанени индивидуално (n = 7–9/група), със свободен достъп до диета с високо съдържание на мазнини и захароза в западен стил (58% kcal мазнини, 13% kcal захароза) или контролна диета (10,5% kcal мазнини, 0% kcal захароза; Research Diets Inc, New Brunswick, NJ). Телесното тегло и консумацията на храна се отчитат седмично. GTT се извършват след 1, 3 и 6 месеца хранене с диета, както е описано по-горе. Мишките бяха оставени да се възстановят в продължение на 1 седмица, преди да бъдат бракувани.

Податливост към нараняване на черния дроб

WT и 5αR1-KO мъжки мишки (∼5 m) бяха третирани чрез интраперитонеална инжекция с 0.3 μL/g въглероден тетрахлорид (CCl4) в зехтин (n = 8/група) или носител (n = 4/група) два пъти седмично в продължение на 6 седмици (24). Телесното тегло се записва седмично и мишките се бракуват 48 часа след последното инжектиране с CCl4.

Метаболитни ефекти на фармакологичното инхибиране на 5αR

Zucker плъхове (n = 10–15/група, на възраст 6 седмици) се третират с 5αR инхибитор финастерид (0,35 mg/kg/d) или носител (5% етанол; 1 ml/kg/d) чрез ежедневна сонда. Финастеридът инхибира двата изоензима на 5αR при плъхове (21,25). След 2 седмици резултатите от орален GTT се оценяват на 0, 30 и 120 минути след прилагане на глюкозен болус (26). След допълнителна седмица на лечение, плъховете бяха убити. Черният дроб беше бързо замразен и обработен за анализ на преписи. Експериментът е повторен във втора кохорта от затлъстели плъхове, които са били подложени или на двустранна гонадектомия, или на фалшива операция (6) 4 седмици преди започване на лечение с финастерид или носител.

Лабораторни анализи

Плазмена биохимия

Кортикостеронът е измерен чрез радиоимуноанализ (27), инсулин чрез ELISA (Crystal Chem, Downers Grove, IL), глюкоза по метода на хексокиназата (Thermo Electron, Мелбърн, Виктория, Австралия), адипокини и аполипопротеини (апо) от Lincoplex имуноанализи (Dundee, Великобритания) и триглицериди и холестерол (MICROgenics, Passau, Германия) и нестерифицирани мастни киселини (NEFA) (Zen-Bio) спектрофотометрично. Тестостеронът и финастеридът се определят количествено в плазмата на плъхове (1 ml), както е описано по-рано (20), но са адаптирани за по-голям обем (1 ml) чрез използване на патрони Oasis HLB (60 cm 3; Waters, Elstree, UK).

Биохимия на тъканите

За измерване на триглицеридите, 50–100 mg черен дроб е механично хомогенизиран в пропан-2-ол (20 об. За мишки на диета с високо съдържание на мазнини; 10 об. За мишки с диета с нормално съдържание на мазнини и плъхове) и е изследван спектрофотометрично (28).

Количествено определяне на иРНК чрез количествена PCR в реално време

Общата РНК се екстрахира, използвайки системата Qiagen RNeasy, и 500 ng се транскрибира обратно в cDNA с произволни праймери, използвайки QuantiTect DNase/комплект за обратна транскрипция. cDNA (еквивалентна на 1 ng обща РНК) се инкубира в три екземпляра с генно специфични праймери и флуоресцентни сонди (допълнителна таблица 1) (Universal Probe Library, Roche Diagnostics, Burges Hill, UK; или Applied Biosystems, Warrington, UK) в 1 × Roche LightCycler 480 сонди mastermix. Количествената PCR беше проведена с помощта на Roche LightCycler 480. Изградена беше стандартна крива за всяка праймерна сонда, използваща серийно разреждане на cDNA, събрана от всички проби. Резултатите бяха коригирани за аритметичната средна стойност на изобилие от референтни гени (за експеримент с високо съдържание на мазнини: Ppia, Rn18s и Tbp; за експеримент CCl4: Actb и Ppia; за експеримент с плъхове: Ppia и Rn18S), които не се различават между групите.

Количествено определяне на чернодробна фиброза

Фиксираният черен дроб се разрязва (5 µm) и се оцветява с хематоксилин-еозин или пикросириус червено. Разрезите бяха изследвани чрез светлинна микроскопия (увеличение 10 ×; микроскоп Axio Scope; Zeiss) и заснети с помощта на камера CoolSNAP (Photometrics). Червеното петно ​​на Picrosirius беше количествено определено чрез преброяване на броя на червените пиксели в 20 произволно избрани зрителни полета от всяка секция, използвайки софтуера Adobe Photoshop версия 5.0. Данните са представени като средния брой червени пиксели на зрително поле, което е представително за количеството оцветени колагени.

Профил на преписи на 5αR1 и 5αR2 в метаболитни тъкани

Експресията на 5αR1 и 5αR2 иРНК се оценява в черния дроб; подкожна мастна тъкан и скелетни мускули от WT мишки и плъхове; и простатата от плъхове като положителен контрол за 5αR2. cDNA (10 ng; приготвена, както е описано по-горе) беше подложена на PCR, използвайки системата Qiagen HotStarTaq Plus (Qiagen, Crawley, UK), и продуктите бяха електрофорезирани върху 1.2% агарозен гел в 0.5 × Tris-borate-EDTA буфер. Праймерите бяха миши 5αR1 tttgctcttcctttgggcta и ctgccatcaattccttggat и 5αR2 aacacagcgagagtgtgtcg и cgcgcaataaaccaggtaat; и плъх 5αR1 tttgctcttcctttgggcta и ccaaacagggtctccctaca и 5αR2 gttgccttcctttgtggtgt и tgattcccatccccagaata.

Статистически анализ

Профил на стенограмите на 5αR1 и 5αR2 в метаболитни тъкани на мишки и плъхове. О: При мишки 5αR1 (240 BP) се открива в черния дроб, скелетните мускули и мастната тъкан, докато 5αR2 (299 BP) се открива само в черния дроб и мастната тъкан. B: При плъхове 5αR1 (181 BP) се открива в черния дроб, скелетните мускули и мастната тъкан, докато 5αR2 (308 BP) се открива само в положителната контрола на простатата. A и B: ленти 1, 5 и 9, 100 BP стълба; път 2, черен дроб 5αR1; път 3, черен дроб 5αR2; линия 4, отрицателен контрол на черния дроб; лента 6, мускул 5αR1; лента 7, мускул 5αR2; лента 8, мускулен отрицателен контрол; лента 10, мастна 5αR1; лента 11, мастна 5αR2; лента 12, мастна отрицателна контрола. B: Път 13, простата 5αR2; лента 14, отрицателен контрол на простатата.

Дефицитът на 5αR1 увеличава податливостта към метаболитна дисфункция при хранене с високо съдържание на мазнини

Мишките 5αR1-KO, които ядат нормално чау, не се различават по тегло и имат само незначителни разлики в метаболитния фенотип от WT мишки преди 5-месечна възраст (допълнителна таблица 2). Глюкозната непоносимост е открита на 3-месечна възраст, а тенденция към хиперинсулинемия по време на GTT е установена на 5-ия месец, но няма разлика в телесните мазнини.

Докато ядат диета с високо съдържание на мазнини, обаче, 5αR1-KO мишките са имали повишена податливост на наддаване на тегло (фиг. 2А и допълнителна фиг. 1), хиперинсулинемия (на гладно и по време на GTT; (Таблица 1 и фиг. 2C), увеличени съотношения на инсулин към глюкоза (фиг. 2G) и натрупване на мазнини в черния дроб (фиг. 3C). Наддаването на излишно тегло се разпределя между няколко органа, включително чернодробни и мастни депа (Таблица 1). Промените в плазмените липидни и адипокинови профили при хранене с високо съдържание на мазнини се различават незначително от тези на WT мишки (Таблица 1). Потискането на липолизата (измерено чрез потискане от NEFA през първите 15 минути от GTT) се засилва при 5αR1-KO мишки (фиг. 2Н).

Индекси на метаболизма при 5αR1-KO мишки спрямо WT контроли

Чернодробна фиброза след увреждане на CCl4 при 5αR1-KO и WT мишки. Представителни изображения на чернодробни разрези (5 µm), оцветени с пикросириус в червено, за да се покаже отлагането на колаген. Колагенът не се открива при WT мишки (A) или KO мишки (B), получаващи инжекции от носител. Мишките с дефицит на 5αR1 имат по-голяма индукция на колаген след прилагане на CCl4, включително доказателства за свързваща фиброза (KO) (D), в сравнение с WT контролите (C).

Фармакологично инхибиране на 5αRs при плъхове имитира фенотипа на 5αR1 дефицит при мишки

Ефект на двойно инхибиране на 5αR върху метаболитни аномалии при мъжки плъхове Zucker със затлъстяване. Повишаването на теглото през 3-седмичния период на лечение (A) и чернодробното тегло, измерено в прясна тъкан (B), не се променят от финастерид (Fin) в сравнение с лечение с носител (Veh). AUC за глюкоза (C) и инсулин (E) за 90-минутна продължителност на пероралния GTT се увеличава след лечение с финастерид. Глюкозата е по-висока на 30 и 90 минути (D), а инсулинът е по-висок на 30 минути (F) след приложение на глюкоза при затлъстели плъхове, лекувани с финастерид (пунктирана линия) в сравнение с носител (плътна линия). Плазмените нива на триглицеридите (G) не са засегнати, а нивата на чернодробните триглицериди (H) са увеличени от финастерид. Изобилието на иРНК в черния дроб, измерено чрез количествена PCR в реално време и коригирано за средната стойност на изобилието от референтни гени (Rn18s и Ppia) (I). Сивите решетки са контролни затлъстели плъхове, а ивичестите решетки са затлъстели плъхове, получили финастеридно лечение. Данните са средната стойност ± SEM в сравнение с t тест на Student. * P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Метаболитни последици от фармакологичното инхибиране на 5αRs

Дискусия

Тези данни показват, че ензимът 5αR1 влияе върху предразположението към метаболитно заболяване, като засяга не само предразположението към чернодробна стеатоза, но също така влияе върху разпределението на телесните мазнини и инсулиновата чувствителност. Нещо повече, повишената чувствителност към стеатоза е придружена от повишена чувствителност към фиброзно чернодробно увреждане, което предполага, че 5αR дефицит или инхибиране може да бъде свързано с ускорено прогресиране на неалкохолна мастна чернодробна болест. Подобни наблюдения с фармакологично инхибиране на 5αR при плъхове подчертават потенциалната важност на тези наблюдения при мъже, лекувани с 5αR инхибитори (20).

Важно е, че развитието на стеатоза при плъхове е установено при всички животни, лекувани с финастерид, и изглежда е независимо от синтеза на андроген, персистиращ при кастрирани мъжки плъхове. Други съобщават наскоро, че 5αR1-KO мишките са по-податливи на хепатоцелуларен карцином след продължително хранене (12 месеца) на американската диета, предизвикана от затлъстяване (ALIOS) (19) и че чернодробните транскрипти се променят при мишките 5αR1-KO с тези, индуцирани от прилагането на глюкокортикоиди, а не на андрогени (19). Като се има предвид, че сме демонстрирали нарушен чернодробен метаболитен клирънс на кортикостерон при 5αR1-KO мишки (11) и персистиране на ефекта на финастерид при GDX плъхове, заключаваме, че локалният излишък на глюкокортикоиди е най-вероятният механизъм в основата на чернодробната стеатоза при 5αR1 дефицит или инхибиране; комбинираните промени в андрогенната и/или глюкокортикоидната сигнализация могат да допринесат за други аспекти на неблагоприятния метаболитен фенотип.

Наскоро публикувано проучване (19) документира подобна чувствителност към чернодробна стеатоза при 5αR1-KO мишки, хранени с диета ALIOS, но не показва промени в разпределението на телесните мазнини или чувствителност към инсулин и няма разлика в чернодробната фиброза. Вероятно нашите експерименти са предизвикали по-голямо метаболитно предизвикателство, с по-високо съдържание на мазнини в диетата и по-голяма степен на увреждане на черния дроб, предизвикано от CCl4. Предишното проучване обаче съобщава само за измервания на глюкозата, направени по време на GTT и не открива разлики между генотипите в нивата на глюкоза на гладно или AUC. Тук ние също показваме нормални нива на глюкоза, но демонстрираме, че инсулиновият отговор на глюкозното предизвикателство е повишен, което съответства на инсулиновата резистентност. Интересното е, че предишното проучване показа, че въпреки наличието на стеатоза, 5αR1-KO мишките на диетата ALIOS са били защитени срещу хепатоцелуларен карцином, по-нататъшна патология надолу по веригата, въпреки че карциномът не е бил очевиден в никоя от изследваните тук групи.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на д-р Мала Махендроо (Югозападен медицински център на Тексаския университет, Далас, Тексас) за нейната подкрепа. Авторите също благодарят на Wellcome Trust и British Heart Foundation за финансовата им подкрепа; Carolynn Cairns, Scott Denham, Karen French, Jill Harrison, Sanjay Kothiya и Rachel McDonnell (University of Edinburgh) за отлична техническа поддръжка; персоналът на генетичните скринингови и интервенционни технологии, Университет в Единбург, за услуги по редеривация; Университетските изследователски центрове за хистология, Университет в Единбург, за хистологични услуги; и ядрото за лаборатория за масова спектрометрия на Центъра за клинични изследвания Wellcome Trust (Университет в Единбург) за аналитична подкрепа.

Финансиране. Това изследване беше подкрепено от Wellcome Trusthttp: //dx.doi.org/10.13039/100004440 grant 072217/Z/03/Z и British Heart Foundation http: //dx.doi.org/10.13039/501100000274 grants FS/08/063 и FS/08/065.

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.