Ян Ченг и Джианджи Чен

декорацията

Болница за инфекциозни болести в нов район Пудунг

# 46, Lane 3018, East Huaxia Road, Шанхай 201299, (ПР Китай)

Имейл [email protected]; [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Клетките на Kupffer, пребиваващите в черния дроб макрофаги, произхождат от миеломоноцитната популация, колонизират се в чернодробните синусоиди и представляват 20% от непаренхимните клетки в черния дроб [14]. Натрупаните проучвания показват, че Kupffer клетките са най-важните имунни клетки в патогенезата на NAFLD и също така са основните клетки на възпалителните медиатори на затлъстяването и инсулиновата резистентност [15-17]. Клетките на Kupffer са първата защитна бариера в черния дроб и играят важна роля за вродения имунитет на черния дроб чрез сигнализиране на Toll-подобен рецептор (TLR) [18]. Активираните клетки на Kupffer могат да участват в патогенезата на NAFLD по различни пътища [19-22]. Първо, активираните клетки на Kupffer взаимодействат с други чернодробни клетки, включително хепатоцити, и отделят различни биоактивни вещества като цитокини, хемоаттрактанти, протеолитични ензими и реактивни кислородни видове (ROS), за да предизвикат биохимични атаки [5, 23]. Второ, активираните клетки на Kupffer могат да доведат до вторичен възпалителен отговор чрез секретиране на хемокини и експресиране на адхезионни рецептори за набиране на неутрофили, Т лимфоцити, NK клетки и макрофаги, получени от кръвни моноцити в черния дроб [5, 23]. По този начин насочването към активирането на клетките на Kupffer може да бъде ключов подход за потискане на прогресията на NASH [19].

Отварата Cangju Qinggan Jiangzhi (CQJD), традиционно китайско лекарство (TCM), формулирана в нашата болница, се състои от Atractylodes chinensis (6 g), пържени атрактилоди (10 g), лотосов лист (10 g), касия (10 g), хризантема (10 g) и Typha angustifolia (6 g). CQJD се използва за лечение на NAFLD в нашата болница и доведе до добър резултат. CQJD може ефективно да подобри симптомите на пациента и лабораторните биохимични показатели. В допълнение, нашите предишни експерименти показаха, че CQJD може ефективно да подобри чернодробната стеатоза и степента на възпалително увреждане на черния дроб в модел на мишка, индуцирана от CCl4, (статия на китайски). Въпреки това, малко се знае дали CQJD произвежда защитен ефект срещу NASH и свързаните с него механизми, които са в основата, остават да бъдат изяснени.

В това проучване ние се опитахме да изследваме потенциалната терапевтична роля на CQJD в регулацията на активирането на клетките на Kupffer и патогенезата на NASH. Диетите с високо съдържание на мазнини (HFD) и затлъстяването водят до хронично състояние на нискостепенно възпаление, повишено производство на ROS и клетъчна смърт. Следователно първо проверихме дали CQJD играе роля в патогенезата на HFD-индуцирано увреждане на черния дроб. Използвайки това in vivo Наблюдавахме дозозависим защитен ефект на CQJD върху увреждане на черния дроб, натрупване на липиди, възпаление и митохондриален оксидативен стрес в черния дроб. Нещо повече, за да подобрим допълнително транслационния потенциал на нашето проучване, ние също така определихме ролята на CQJD в диетично-индуциран от метионин и холин (MCD) модел на мишка NASH на мишка [24].

Материали и методи

Модел на мишка NASH

Преди това се съобщава за модел на мишка NASH, предизвикан от диета с високо съдържание на мазнини [25]. Накратко, мъжки мишки C57BL/6J (20 до 25 g телесно тегло) на възраст 8-12 седмици са закупени от Шанхайския център за лабораторни животни. Всички хирургични и грижовни процедури, прилагани на животните, са в съответствие с институционалните насоки на Шанхайския център за лабораторни животни. Всички мишки бяха настанени при 21 ± 1 ° C с влажност 55 ± 10% и 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл със свободен достъп до храна и вода. След като мишките са се адаптирали към околната среда, мишките C57BL/6J в нормалната контролна група са били хранени със стандартна диета с чау, докато останалите са били хранени с HFD (приблизително 1,67 kcal/g), който е съставен от 79,5% царевичен прах, 0,5% холестерол и 20% свинска мас. За генерирането на модел на мишки с дефицит на метионин и холин (MCD), групи (n = 8) от 8-седмични мъжки мишки C57BL/6J бяха поставени на MCD диета, докато контролите бяха хранени със същата диета, допълнена с метионин и холин.

Подготовка на CQJD

Прием на храна и телесно тегло

Приемът на храна и телесното тегло на мишката се записват ежедневно. За да се определи ефектът от CQJD върху приема на храна, мишките се поддържат на HFD (11 седмици) и се третират с 10 mg/kg CQJD (ниско), 50 mg/kg CQJD (високо) или носител за допълнителни 8 дни.

Изолиране на клетки на Kupffer

Клетките на Kupffer бяха изолирани чрез двуетапна перфузия на колагеназапроназа на черен дроб на мишка, последвана от 15% Nycodenz (Sigma, D2158, Shanghai, China) двуслойно прекъснато центрофугиране с градиент на плътност. Чистотата на културите се оценява чрез поточен цитометричен анализ и сортиране на клетки с магнитно антитяло (анти-F4/80 антитяло). Изолирани клетки на Kupffer се култивират в продължение на 24 часа в модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM), съдържаща 10% фетален говежди серум и 1% антибиотици (100 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин) в овлажнен инкубатор при 37 ° C с 5% CO2. За активиране на Kupffer клетки, липополизахарид (LPS) (1 ng/mL; Sigma; L2880) и/или палмитинова киселина (400 μM; Sigma; P5585) се добавят към културалната среда и клетките се стимулират допълнително в продължение на 12 часа. Клетките бяха предварително обработени с CQJD в продължение на 2 часа преди приложението на LPS или палмитинова киселина.

Количествена PCR в реално време

Оцветяване с хематоксилин и еозин

Чернодробната тъкан беше фиксирана в 10% формалин и вградена в парафин. Прясна чернодробна тъкан се замразява при съединение с оптимална температура на рязане (OCT) върху сух лед и се криосектира на 5 μm участъци. Чернодробните проби бяха оценени чрез светлинна микроскопия.

Измерване на чернодробните триглицериди

Събраните чернодробни тъкани се хомогенизират в хлороформ/метанол (2: 1 v/v) с помощта на мелничка за тъкани Polytron и липидните екстракти се приготвят по класическия метод на Folch, както беше съобщено по-рано [10]. Екстрактите бяха изсушени и разтворени в изопропанол. Нивата на чернодробните триглицериди са измервани биохимично, като се използва триглицеридният реактивен комплект (Jiancheng Bioeng. Com., Nanjing, Китай).

Измерване на серумните ALT и AST

Получените кръвни проби се държат при стайна температура в продължение на 1 h. След това серумът се събира след центрофугиране при 840 × g за 15 минути. Активността на плазмената аланин амино трансфераза (ALT) и аспартат амино трансаминаза (AST) беше измерена с помощта на търговски комплект от Rsbio (Шанхай, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя.

Откриване на активността на Caspase-3/7

Активността на Caspase-3/7 също се измерва с помощта на комплекта за анализ на Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 (Promega, Madison, WI) в съответствие с инструкциите на производителя.

Измерване на активността на MPO

Активността на MPO се определя въз основа на реакцията на хлороводородна киселина с таурин за получаване на таурин хлорамин и последващото измерване на този окислител с помощта на 3, 3 ', 5, 5'-тетраметилбензидин реагент съгласно инструкциите на производителя (Sigma-Aldrich, Шанхай, Китай).

Измерване на M1dG

Накратко, ДНК се изолира чрез стандартни техники. Количеството и качеството на ДНК се измерва с помощта на спектрофотометър Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, САЩ). Техниката на 32P след маркиране се използва за измерване на нивата на 3- (2-дезокси-р-d-еритро-пентофуранозил) пиримидо [1,2-а] пурин-10 (ЗН) -он (M1dG). Откриването и количественото определяне на M1dG адуктите и общите нуклеотиди бяха получени чрез система за фосфорно изобразяване (Typhoon 9210, Amersham) и ImageQuant софтуер (Molecular Dynamics, Сънивейл, Калифорния).

Измерване на 4-HNE и 3-NT

Нивата на 4-HNE в черния дроб са измерени с помощта на търговски комплект от (Cell Biolabs, САЩ). Накратко, BSA или чернодробните тъканни хомогенати (10 μg/ml) се абсорбират върху 96-ямкови плаки. HNE в тъканните проби се улавя с анти 4-HNE антитяло, последвано от HRP-конюгирано вторично антитяло. Нивото на 4-HNE в пробите се определя въз основа на стандартна крива, генерирана с BSA-HNE в съответствие с инструкциите на производителя. За откриване на чернодробни 3-NT нива е използван търговски ELISA комплект от Abcam (ab116691, Шанхай, Китай).

ELISA анализ на TNFα, IL1β и CCL2

С ELISA тест нивата на TNFα, IL1β и CCL2 бяха измерени от супернатантите на клетъчни култури чрез имуноанализи на мишки (R&D Systems, Minneapolis, MN), в съответствие с инструкциите на производителя.

Статистически анализ

Сред компонентите на CQJD е доказано, че няколко екстракта играят защитна роля срещу увреждане на черния дроб. Основните екстракти от Atractylodes chinensis, Atractylone и β-евкалиптол, могат ефективно да намалят серумните нива на ALT, AST в модела на мишка с остро увреждане на черния дроб, причинено от CCl4. Екстрактът от хризантема може да инхибира натрупването на чернодробни липиди при NAFLD мишки и механизмът може да бъде свързан с увеличаване на антиоксидационния ефект върху черния дроб. An et al. установи, че флавоноидите от листа на лотос могат да инхибират патогенезата на NAFLD при мишки чрез намаляване на нивото на чернодробните триглицериди [39]. Luo et al. съобщава, че компонентът на екстракт от касия, антрахинон, може да предотврати алкохолно мастно чернодробно заболяване чрез регулиране на метаболизма на мазнините, анти-липидно окисление и увеличаване на PPAR-γ иРНК и протеинова експресия [40]. В това проучване нашето in vivo и инвитро експериментите показват, че CQJD може ефективно да намали HFD и MCD диета, индуцирана NASH патогенеза, както се демонстрира от намаленото увреждане на черния дроб и стеатоза, намалено отлагане на чернодробни липиди и значително подобрена биохимична функция на черния дроб. Точният механизъм, лежащ в основата на подробната роля на всеки компонент на CQJD, изисква по-нататъшно разследване.

В заключение, настоящите данни потвърждават терапевтичните роли на CQJD в индуцирания от HFD и MCD NASH чрез облекчаване на стеатозата, намаляване на производството на възпалителни цитокини и активиране на Kupffer клетки. Нашите данни показват, че CQJD може да представлява обещаващ нов път за лечение на NASH. Въпреки това, механистичното значение на CQJD в активирането на клетките на Kupffer в NASH се нуждае от допълнително проучване, тъй като тази информация може да осигури по-точен терапевтичен път за това често срещано чернодробно заболяване.

Благодарности

Тази работа беше финансирана от Програма за обучение на изключителни лидери на здравното бюро Pudong в Шанхай (грант № PWRL2016-01) и проекти за строителство на ключови дисциплини „TCM hepatology“ (PWZxk2017-30).

Декларация за оповестяване

Авторите потвърждават, че няма конфликт на интереси.