Експериментално
и терапевтични
Лекарство

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Хонгсия Ли
• Хонгин Ву
• Юе Гао
• Шаохуа Кай

Тази статия се споменава в:

Резюме

Въведение

Едно от най-честите усложнения след лъчетерапия за лечение на тумори на гърдата е индуцираното от лъчението увреждане на белия дроб. Два различни клинични етапа се разпознават при индуцирана от радиация белодробна болест: Ранен, преходен стадий, характеризиращ се с радиационен пневмонит и по-късен етап, характеризиращ се с хронична лъчева фиброза, оказващ влияние върху скоростта на локален туморен контрол, прогнозата и качеството на живот след лъчетерапия.

Традиционната китайска медицина или билковата медицина е важен подход при лечението на увреждане на белите дробове. Ефективна серия за лечение, известна на китайски като Yangyinqingfei, е разработена от лекарите за намаляване на възпалителните медиатори на белия дроб. Смята се, че отварата Yangyinqingfei изхвърля вятъра, премахва влагата и насърчава кръвообращението за облекчаване на болката, ободряване на далака и регулиране на ци (18). Отварата Yangyinqingfei традиционно се използва за лечение на дифтерия (19). Има малко доклади за това билково лекарство, особено по отношение на механизма, лежащ в основата на лечението на радиационно-причинено увреждане на белия дроб. В това проучване терапевтичните ефекти на отварата Yangyinqingfei бяха оценени в модел на плъх с радиационно-индуцирано увреждане на белия дроб и беше изследван потенциалният механизъм, лежащ в основата на ефекта.

Материали и методи

Yangyinqingfei отвара

Отварата Yangyinqingfei е закупена от аптеката за традиционни китайски лекарства на Общата болница на народната освободителна армия (Пекин, Китай). Рецептата за отвара Yangyinqingfei се състои от следните пет китайски билки: Sheng Di Huang (15 g), Xuan Shen (15 g), Verbena (15 g), Forsythia (10 g) и Gan Cao (6 g). Количеството на всяка билка в отварата Yangyinqingfei се определя, като се използва информация от Комисията по фармакопея на Китайската народна република (20). Накратко, всяка билка се декоктира чрез къкри във вода в продължение на 30 минути, преди да се филтрира през филтърна хартия и след това се концентрира в отвари от 0,2, 0,6 и 1,8 g/ml. Екстрактите се съхраняват при 4 ° С до употреба.

Условия и лечение на животните

Хистопатологично изследване

На една, две и четири седмици след облъчването, пет животни от всяка група бяха умъртвени и белодробните тъкани бяха събрани. Десните белодробни тъкани бяха вградени в парафин и бяха разрязани с дебелина 5 μm, преди да бъдат оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и наблюдавани под светлинен микроскоп [Olympus (BH-2), Нагано, Япония].

Western blot анализ

За да се оценят нивата на протеин на MMP-12 и TIMP-1 в белодробните тъкани, беше извършен Western blot анализ. Белодробните тъкани бяха адекватно хомогенизирани с неденатуриращ лизисен буфер и центрофугирани при 12 000 × g в продължение на 15 минути при 4 ° С. Концентрацията на протеин в супернатантата се определя преди денатурацията на протеина, използвайки протеинов зареждащ буфер. След това общо 30 μg протеин се зарежда върху 12% SDS полиакриламиден гел, попива се върху мембрана от поливинилиден дифлуорид и се блокира за 1 h с 5% обезмаслено мляко в буфериран с Tris солев разтвор с 0,05% Tween 20. Мембраните се инкубират с първични антитела срещу MMP-12, TIMP-1 и β-актин (1: 1000; Takara Bio, Inc., Shiga, Япония) в продължение на една нощ при 4 ° C, последвано от 2-часова инкубация с конюгирано вторично антитяло от хрян пероксидаза (1: 3000; Санта Круз Биотехнология, Inc., Санта Круз, Калифорния, САЩ). Мембраните бяха измити с TBS-T буфер три пъти и след това визуализирани с помощта на засилено хемилуминесценция (ECL; Amersham, Piscataway, NJ, USA).

Анализ на екстракция на РНК и обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR)

Общата РНК беше извлечена от белодробни тъкани с реагент TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Германия). Общата РНК (1 μg) се транскрибира обратно в cDNA, която след това се използва за определяне на нивата на MMP-12 и TIMP-1 mRNA, използвайки PCR с Taq ДНК полимераза (Fermentas, Pittsburgh, PA, USA). PCR се извършва при следните условия: Първоначално денатуриране при 94 ° С за 30 секунди, отгряване при 58 ° С за 30 секунди и удължаване при 72 ° С за 1 минута, последвано от 30 цикъла на усилване за MMP-12 и TIMP-1 и 35 цикъла за β-актин. Последователностите на праймера за MMP-12, TIMP-1 и β-актин са проектирани със софтуера Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft, Пало Алто, Калифорния, САЩ) и са както следва: MMP-12 напред 5′-AGGTCAAGATGGATGAAGCGG-3 ′, реверс 5′-GAAGTAATGTTGGTGGCTGGACTC-3 ′; TIMP-1 напред 5′-ACAGCTTTCTGCAACTCG-3 ′, обратен 5′-CTATAGGTCTTTACGAAGGCC-3 ′; β-актин напред 5′-TGGCCTCACTGTCCACCTTC-3 ′, обратен 5′-CGAATGGCTGACCATTCAGA -3 ′. Всички процеси бяха извършени в съответствие с инструкциите на производителя. След това пробите се анализират с помощта на гел електрофореза (2% агароза), изследват се ДНК ленти и нивото на ДНК се измерва полуколичествено с помощта на Гел Документационна система (Bio-Rad Model Gel Doc 2000; Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Статистически анализ

Таблица I

Телесно тегло на плъхове след облъчване със или без приложение на отвара Yangyinqingfei.

Таблица I

Телесно тегло на плъхове след облъчване със или без приложение на отвара Yangyinqingfei.

Фигура 1

Хистопатологични промени в белите дробове след облъчване със или без лечение с отвара Yangyinqingfei. (А) контролна група; (B) моделна група (облъчени плъхове без приложение на лекарство); (C) група за лечение с ниски дози (2 g/kg/ден); (D) група за лечение на междинни дози (6 g/kg/ден); (E) група за лечение с високи дози (18 g/kg/ден). Плъхове от група А получиха фалшиво облъчване; други са облъчени с единична доза от 25 Gy до десния полукръвен кош с γ-лъч 60Co. Плъховете бяха умъртвени една, две или четири седмици след облъчването и белодробните секции показаха различна степен на задръствания и срутени алвеоли след облъчване на γ-лъчи 60Co с или без приложение на отвара Yangyinqingfei. Оцветяване с хематоксилин и еозин; увеличение, × 200. p.i., след облъчване.

Ефекти от отварата Yangyinqingfei върху експресията на MMP-12 и TIMP-1

За да се изследват ефектите на отварата Yangyinqingfei върху експресията на иРНК и протеини на MMP-12 и TIMP-1 при плъхове с индуцирана от радиация белодробна травма, бяха проведени RT-PCR и Western blot анализ, съответно. Както е показано на фиг. 2А, нивото на MMP-12 иРНК в белодробните тъкани се е увеличило след облъчване и е достигнало връх след две седмици след облъчването; обаче, на четири седмици след облъчването нивото на иРНК беше намалено значително. За разлика от това, нивото на TIMP-1 иРНК в белодробните тъкани се повишава след облъчване и е най-високо четири седмици след облъчването. В сравнение с група В, нивата на MMP-12 и TIMP-1 иРНК в групи C-E са намалени. Тези резултати показват, че отварата от Yangyinqingfei има инхибиращ ефект върху експресията на иРНК на MMP-12 и TIMP-1, особено при по-високата доза.

Фигура 2

Ефект на отварата Yangyinqingfei върху експресията на MMP-12 и TIMP-1. В различни моменти от време след облъчването, общата РНК се извлича от белодробни тъкани и се извършва обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция и Western blot анализ. (А) експресия на иРНК на MMP-12 и TIMP-1 една, две и четири седмици след облъчване; (B) протеинова експресия на MMP-12 и TIMP-1 една, две и четири седмици след облъчването. β-актинът е използван като вътрешен контрол. а, контролна група; b, моделна група (облъчени плъхове без приложение на лекарство); c, група за лечение с ниски дози (2 g/kg/ден); d, група за лечение на междинни дози (6 g/kg/ден); д, група за лечение с високи дози (18 g/kg/ден); ММР-12, матрична металопротеиназа-12; TIMP-1, тъканни инхибитори на матрична металопротеиназа-1; p.i., след облъчване.

Нивата на протеин на MMP-12 и TIMP-1 се наблюдават в белодробната тъкан, използвайки Western blot. Както е показано на фиг. 2В, MMP-12 и TIMP-1 протеините се изразяват положително във всяка група. Нивата на експресия на протеин на MMP-12 и TIMP-1 са значително увеличени в група В след облъчване в сравнение с тези от група А. В сравнение с група В, протеиновата експресия на MMP-12 и TIMP-1 е ефективно регулирана в групи CE, особено в група D; нивата на експресия обаче останаха по-високи от тези в група А. Този резултат допълнително демонстрира инхибиторния ефект на отварата Yangyinqingfei върху експресията на MMP-12 и TIMP-1.

Дискусия

В настоящото проучване беше демонстрирано, че отварата Yangyinqingfei упражнява защитен ефект върху плъхове с индуцирана от радиация белодробна травма. Механизмът, лежащ в основата на този защитен ефект, може да включва намаляване на експресията на MMP-12 и TIMP-1.

Патологичните промени в индуцираното от радиация белодробно увреждане включват интерстициална белодробна конгестия и оток, възпалителна клетъчна инфилтрация, интерстициална хиперплазия на белодробни влакна и алвеоларна атрофия (21). Понастоящем радиационното увреждане на белите дробове е утвърден модел при плъхове, който е използван в многобройни проучвания (22, 23). В настоящото проучване плъховете Wistar са облъчени, за да предизвикат нараняване на белите дробове. Една седмица след облъчването се наблюдават оток на алвеоларната стена и запушване на капилярите. Две седмици след облъчване се наблюдава инфилтрация на макрофаги. Удебеляването на алвеоларната преграда и алвеоларната структура изчезват четири седмици след облъчването. Лезиите са доминирани от признаци на хронично възпаление, видима фибробластна хиперплазия и удебеляване на алвеоларните прегради, както и свиване или компенсаторно разширяване на алвеоларното пространство. По този начин моделът на плъхове за индуцирана от радиация белодробна травма беше успешно установен.

В това проучване резултатите показват, че ранната интервенция с отвара Yangyinqingfei облекчава белодробния оток, задръстванията, възпалението и удебеляването на алвеоларната преграда в сравнение с моделната група (група В). Това показва, че ранното прилагане на отвара Yangyinqingfei може да бъде ефективно за контрол и смекчаване на радиационно-индуцирана белодробна травма. Анализът на хистопатологичните промени в белия дроб показа, че плъховете, прилагащи висока доза отвара Yangyinqingfei, показват намалена интерстициална конгестия на белите дробове, лек оток и по-малко алвеоларно структурно увреждане в сравнение с групите, приемащи по-ниски дози. Въпреки това, плъховете, лекувани с висока доза отвара Yangyinqingfei, показват странични ефекти, включително диария. Тези резултати показват, че дозировката на отварата Yangyinqingfei оказва влияние върху ефикасността на лечението. Въпреки страничните ефекти обаче, отварата от Yangyinqingfei с високи дози показва по-голям защитен ефект срещу радиационно увредено белодробно увреждане, отколкото дозите, използвани в останалите групи.

В заключение, това проучване показа, че отварата Yangyinqingfei има превантивен и терапевтичен ефект върху ранната фаза на радиационно-индуцирано увреждане на белия дроб, механизмът на който може да включва потискане на MMP-12 и TIMP-1. Необходими са обаче по-подробни проучвания, за да се оцени допълнително механизмите, залегнали в наблюдаваните ефекти.

Препратки

Inoue A, Kunitoh H, Sekine I, Sumi M, Tokuuye K и Saijo N: Радиационен пневмонит при пациенти с рак на белия дроб: ретроспективно проучване на рисковите фактори и дългосрочната прогноза. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 49: 649–655. 2001. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Todd NW, Luzina IG и Atamas SP: Молекулярни и клетъчни механизми на белодробна фиброза. Ремонт на тъкани от фиброгенеза. 5: 112012. Преглед на статия: Google Scholar

• Ефект от хирургично индуцирана загуба на тегло върху биомаркери на ендотелната дисфункция систематично
• Ефект на инфекцията с псевдомонада върху отслабването, белодробната механика и цитокините при американски мишки
• Ефект на екстракта от Myristica fragrans върху общия състав на тялото при затлъстели плъхове, предизвикани от диета
• Джинджифил и диабет - Ефект върху гликемичния контрол, катаракта; Инсулинова секреция
• Ефект от 4-седмично обучение по скандинавско ходене върху физическата годност и самооценката на