Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, методология, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

цекума

Патологичен отдел, Медицински факултет на Университета Джон Хопкинс, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати, Департамент по земеделие, храни и хранителни науки, Университет на Алберта, Едмънтън, Алберта, Канада

Роли Концептуализация, Куриране на данни, Формален анализ, Изследване, Методология

Отдел за научни изследвания на животни, Университет на Небраска, Линкълн, Небраска, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, куриране на данни, разследване, методология, визуализация, писане - преглед и редактиране

Свързана лаборатория за физиология на интегративните системи, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Швейцария

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, методология, администриране на проекти, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Свързана лаборатория за физиология на интегративните системи, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Швейцария

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, разследване, методология, ресурси, софтуер, визуализация

Отделение за генетика, геномика и информатика, Университет на Тенеси, Научен център за здраве, Мемфис, Тенеси, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, администриране на проекти

Партньорски отдел по патология, Медицински факултет на Университета Джон Хопкинс, Балтимор, Мериленд, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, Куриране на данни, Официален анализ, Придобиване на финансиране, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Ресурси, Надзор, Валидиране, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

Отдел за научни изследвания на животни, Университет на Небраска, Линкълн, Небраска, Съединени американски щати

  • Мария Елиса Перес-Муньос,
  • Есен M. McKnite,
  • Евън Г. Уилямс,
  • Йохан Ауверкс,
  • Робърт У. Уилямс,
  • Даниел А. Питърсън,
  • Даниел С. Чобану

Фигури

Резюме

Семейството BXD се превърна в една от най-забележителните генетични референтни популации, за да разбере генетичния и екологичен контрол на фенотипните вариации. Тук оценяваме отговорите на различните нива на мазнини в диетата, като използваме както диета с чау (CD, 13–18% мазнини), така и диета с високо съдържание на мазнини (HFD, 45–60% мазнини). Изследвахме кохорти от щамове BXD, и двамата инбредни родители C57BL/6J и DBA/2J (известни като B6 и D2, съответно), както и B6D2 и D2B6 реципрочни хибриди F1. Сравнителното въздействие на генетичните и диетичните фактори беше анализирано чрез профилиране на редица фенотипове, най-вече на техния бактериален състав в цекума. Родителите на BXD и F1 хибридите изразяват ограничени разлики по отношение на теглото и увеличаването на телесните мазнини на CD. За разлика от това, разликите в щамовете на HFD са значителни за процента телесни мазнини, като DBA/2J натрупва 12,5% повече мазнини от C57BL/6J (P 0.20), когато е подложен на CD, докато са открити важни разлики между щамовете, когато са подложени на HFD (P Фигура 1. Пропорция на състава на телесните мазнини (на 12 седмици) (A) и промените в средното телесно тегло (g) спрямо началото на диетичния експеримент (на възраст от 5 седмици) (B) в C57BL/6J, DBA/2J и техните реципрочни F1 хибридни щамове, подложени на CD и HFD.

Родовите щамове на BXD имат уникални микробни профили на цекума

Нашето изследване на микробиотата на цекума показва пълно различие на микробните съобщества между щамовете C57BL/6J и DBA/2J (Фигура 2А и 2В). DBA/2J мишките имат по-ниска степен на индивидуална индивидуалност (P = 0,0042; Фиг. 2C-отгоре), докато чревните микробиоми на мишките C57BL/6J са по-богати и съдържат по-голям брой или редки видове от тези на DBA/2J мишки (P = 0,0221, фигура 2C-отдолу) (таблица S1). Чревната микробиота на C57BL/6J и DBA/2J е доминирана от Firmicutes, допринасяйки съответно с 62% и 88% (Фигура 2D). Актинобактериите и Bacteroidetes са по-слабо представени в DBA/2J, представлявайки съответно 9% и 1%, в сравнение с C57BL/6J, където тези фили са представени съответно с 18% и 16%. На нивото на родовете Lactobacillus е най-разпространеният род и в двата щама, макар и по-висок при DBA/2J от C57BL/6J (съответно 49% и 21%). Bifidobacterium и Turicibacter са следните два най-разпространени рода в C57BL/6J (15% и 7%), докато тяхното изобилие в DBA/2J е незначително (Фигура 2. Чревен микробиомен състав на родителски щамове.

Групирането на проби от NMDS на различието на Bray Curtis (A) и дендрограмата на непретеглените разстояния на Unifrac (B) показват, че микробните съобщества на мишки C57BL/6J са различни от тези на мишките DBA/2J. Анализът на различието на Брей Къртис (C-top) като мярка за β-разнообразие показва, че мишките DBA/2J имат по-ниска степен на индивидуална индивидуалност, докато анализът на α-разнообразие на индекса Chao 1 (C-отдолу) показва, че червата микробиомите на мишките C57BL/6J са по-богати и съдържат по-голям брой или редки видове от тези на мишките DBA/2J. Кръговите диаграми и графиките показват относително изобилие (D) на таксони, присъстващи и в двата щама на ниво тип, семейство и род. Taxa, чието изобилие е по-ниско от 1%, са групирани в кръговата диаграма. На графиката вдясно са показани само статистически значими таксони. Статистика: t-тест на Mann-Whitney или множествен t-тест, линиите и стълбовете представляват средно и стандартно отклонение.

Ефектът от пола и клетката на майката е частично объркан и не може да бъде директно оценен. Когато се включи като комбиниран ефект в модела (като съвременна група) заедно със щама, все още се наблюдават разликите между щамовете, съобщени по-горе. В допълнение, комбинирани ефекти от клетката на пола/майката са наблюдавани в класовете Clostridia, Bacilli, Bacteroidia и Deltaproteobacteria (P Фиг. 3. Диетата с високо съдържание на мазнини причинява промени в чревните микробиоми на BXD.

Групирането на проби от NMDS на различието на Bray Curtis (A) и анализът на основните координати (PCoA) на непретеглени и претеглени Unifrac разстояния (B) показват промяна в микробните съобщества на червата в мишките BXD, причинени от HFD. Анализът на показателите за β-разнообразие показва статистически значими разлики между диетичните лечения (С). Кръговите диаграми и графиките показват относително изобилие (D) на таксони, налични и в двата щама на ниво тип и род. Taxa, чието изобилие е по-ниско от 1%, са групирани в кръговата диаграма. Само статистически значими таксони (p Фиг. 4. Cecal sIgA в BXD щамове, подложени на CD и HFD.

HFD индуцира увеличаване на цекалната sIgA, с отговор, който варира при BXD щамове.

При HFD се наблюдават значителни връзки (P ≤ 0,0001) между таксономични единици и чернодробните метаболити при фила, при Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Например, изобилието на Firmicutes е отрицателно свързано с нивото на троксерутин (r = -0,70), флавоноид, известен с потенциалните си антиоксидантни свойства. Lactococcus, член на Firmicutes, се свързва с нивото на кротоноил-CoA (r = 0,72), важен компонент на няколко метаболитни пътища, включително метаболизма на мастните киселини. Наблюдавани са отрицателни взаимоотношения между Parabacteroides, род, принадлежащ на Bacteroidetes, и молибдоптерин-AMP (r = -0,73) и положителни връзки (r = 0,72) с карбамоил фосфат. И накрая, Biophila, род протеобактерии, се свързва с р-крезол глюкуронид (r = 0,71), метаболит, получен в резултат на биотрансформация на тирозин от анаеробни чревни бактерии.

Дискусии

Това проучване предоставя допълнителни доказателства за важни фенотипични и генетични вариации за черти, свързани с метаболитен синдром в две от най-важните генетични линии на мишки, C57BL/6J и DBA/2J и свързаната с тях популация от ресурси BXD RI. Въвеждането на HFD улови разлики между BXD родителски линии и F1 хибриди, които не се виждат в контролния CD. По-конкретно, DBA/2J и F1 хибридите, родени на DBA/2J язовири, натрупват повече телесна мазнина в сравнение с C57BL/6J и F1 хибридите, родени на C57BL/6J язовири, когато са подложени на HFD, което показва по-висока чувствителност към затлъстяване при DBA/2J.

Също така установихме, че родителските щамове BXD имат уникални микробни профили на цекума. На ниво филум, докато и двата щама са били доминирани от Firmicutes, C57BL/6J се характеризира с по-голямо разнообразие, което има важен принос на другите основни типове, Actinobacteria и Bacteroidetes. Докато някои от разликите в микробния профил между родителските щамове са потенциално объркани с ефекта на майчината клетка, групирането на всички проби C57BL/6J, генерирани от 3 различни котила в една и съща филогенетична група, предполага роля на генетиката на гостоприемника в модулацията на микробния профил на цекума. (Фигура 2А и 2В). Нещо повече, въвеждането на HFD в BXD служи като супресор на околната среда, увеличавайки нивата на cecal sIgA, намалявайки разнообразието на микробиотата на цекума, нарушавайки ролята на генетиката на гостоприемника върху състава на чревната микробиота и също засягайки връзките между чревната микробиота и черния дроб метаболити.

IgA представлява важен компонент на адаптивния имунен отговор срещу микробни патогени и може да повлияе на състава на чревната микробна флора [15]. Неотдавнашен доклад установи, че краткосрочното излагане на мишки на HFD (2 седмици) увеличава изобилието на Firmicutes и засяга профила на експресия на възпалителния ген, увеличавайки чувствителността на гостоприемника към инфекция с Listeria monocytogenes [17].

Потенциални доказателства за принос на генетиката на гостоприемника за вариацията на микробиотата на цекума са показани в CD за Oscillibacter/Oscillospira (картографиран на Chr 3) и за Bifidobacterium/Bifidobacterium pseudolongum (картографиран на Chr 6). Въвеждането на HFD в BXD служи като супресор на околната среда на тези QTLs, потенциално поради намаляване на приноса на тези родове в BXD cecum. Потенциалните гени, свързани с QTL ефектите, включват Pde7a (Chr 3) и Txnrd3 (Chr 6). Онтологиите, свързани с Pde7a, включват свързване на метални йони. Основните метални йони са от решаващо значение при важни клетъчни процеси на микробни видове [18]. Анализът на съвместната експресия между Pde7a и известни гени в модули/пътища, базирани на два набора от данни за чревни транскриптоми (GSE59054 и GSE6065, n> 80), използвайки Genebridge (www.systems-genetics.org/) разкрива предполагаема роля за Pde7a да бъде свързан с чревни имунна мрежа за производство на IgA (Резултат> 840; KEGG 04672). Имайки предвид предложената роля на Pde7a в модулирането на пропорцията на Oscillospira, ние предположихме значителна връзка между този вид и sIgA. Както се очаква, нивото на sIgA е корелирано с Oscillospira в CD (r = -0,41, P 0,14), потвърждавайки предполагаемата роля на Pde7a в мрежите за ко-експресия, свързани с производството на IgA в червата.

Txnrd3, потенциалният кандидат-ген, свързан с QTL за Bifidobacterium pseudolongum (Bifidobacterium), е член на семейството на селеноцистеин-съдържащи протеини (селенопротеини), играеща важна роля в редокс хомеостазата [19]. Експресията на Txnrd3 беше намалена при клетъчна линия RAW264.7 на макрофаги при мишки след лечение с липополизахарид (LPS) [20]. Лечението със селен спаси експресията на Txnrd3 и намали имунологичния стрес, свързан с LPS. Диетичният прием на селен влияе върху експресията на селенопротеините гостоприемници, но също така и върху разнообразието на чревната микробиота [21]. Чревната микробиота извлича селена от диетата. В случаите на ограничен прием на селен може да възникне конкуренция между микробиота и гостоприемник. Това състояние може да доведе до намалена експресия на селенопротеини и антиоксидантна активност [22]. Бифидобактериите са способни да натрупват и биотрансформират неорганичен селен, осигурявайки източник на органичен селен за гостоприемника.

Общото увеличение на sIgA в цекалната област при HFD не е свързано с промени в чернодробните метаболити. Обаче при CD се наблюдава отрицателна връзка между нивото на sIgA и галактозилсфингозин (r = -0,73), съединение, свързано с метаболизма на сфинголипид. Сфинголипидите са важни фактори за модулиране на sIgA отговорите [26]. Диетичната палмитинова киселина се метаболизира в сфинголипиди като сфингозин (също субстрат на галактозилсфингозин), който се абсорбира в чревната тъкан и впоследствие се метаболизира в сфингозин 1-фосфат, за който е известно, че модулира трафика на клетки и sIgA отговорите към пероралните антигени.

В заключение резултатите от това проучване демонстрират важната роля на манипулацията на околната среда/диетата върху взаимодействията между генетиката на гостоприемника, имунологичните параметри и стомашно-чревната микробиота и тяхното въздействие върху метаболитите, които могат да служат като показатели за здравословното състояние. Дълбокото разбиране на тези фини взаимоотношения може да предостави знанията, които биха могли да помогнат за деконструиране на причинно-следствените източници на метаболитни нарушения.

Материали и методи

C57BL/6J, DBA/2J и взаимен F1 диетичен експеримент

За да се определи изходното разнообразие на микробиома на цекалите в родителските щамове на BXD, проби от цекума бяха събрани от наивни мъже и жени от C57BL/6J и DBA/2J със средна възраст от 11 седмици. Експерименталните мишки произхождат от три (C57BL/6J, n = 7, средна възраст 72 d) до четири (DBA/2J, n = 6, средна възраст 87 d) котила. Мишките бяха настанени в специфична среда, свободна от патогени, при 20–24 ° C с цикъл светлина/тъмнина от 14/10 часа с свободен достъп до вода и храна в Здравния научен център на Университета в Тенеси (UTHSC). Мъжки и женски кученца са настанени в отделни клетки. Мишките бяха подложени на нормална чау диета (CD, Harlan Teklan 22/5; 17% калории от мазнини, 54% калории от въглехидрати, 29% калории от протеини). Всички животни са били отглеждани в съответствие с насоките, определени от Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни и под ръководството на Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към UTHSC. IACUC в UTHSC специално одобри проучването (Разрешение № 680).

Въздействието на диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) върху телесното тегло и телесния състав е изследвано чрез подлагане на C57BL/6J, DBA/2J и реципрочни F1 хибриди на две диетични лечения в продължение на 8 седмици, започвайки от 5-седмична възраст. Този експеримент включва 4-8 мъжки мишки/щам/диета, подложени или на нормална чау диета (CD, Harlan 7001; 13% калории от мазнини, 53% калории от въглехидрати, 34% калории от протеини) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD), Harlan TD.06415; 45% калории от мазнини, 36% калории от въглехидрати, 19% калории от протеини). Мишките бяха настанени в специфична среда без патогени при 20–24 ° C с цикъл светлина/тъмнина от 14/10 часа и свободен достъп до вода и храна в Университета на Небраска-Линкълн (UNL). Индивидуалното тегло и приемът на храна в клетки са регистрирани седмично, започвайки от седмица 5 до седмица 12. Съставът на тялото, включващ минерална плътност на костите, пропорция на чиста и мастна тъкан, е регистриран на 12 седмици при 4-5 мишки/щам/диета с помощта на PIXImus DEXA. Това проучване е одобрено от UNL IACUC (Разрешение № 422).

BXD диетичен експеримент

Цекума е събрана от мъже на възраст от 29 седмици от 32 щама BXD, изложени на 2 диети, CD и HFD, включително 3-5 животни/щам за всяка диета. В диетата с CD са представени 30 щама BXD (Harlan 2018; 18% калории от мазнини, 58% калории от въглехидрати, 24% калории от протеини), докато 29 щамове BXD са представени в диетата с HFD (Harlan 06414; 60% калории от мазнини, 21% калории от въглехидрати, 18% калории от протеини). HFD е въведен в кохортата на HFD, започвайки от 8 седмици и се поддържа до събирането на тъканите на 29 седмици. Мишките, представляващи всеки щам и диета BXD, бяха настанени в една и съща клетка до 23-та седмица, последвано от индивидуално настаняване до събиране на тъкани на 29 седмици след еднонощно гладуване.

Евтаназията е извършена с използване на анестезия на изофлуран, последвана от пълно вземане на кръв от кухата вена и перфузия с буфериран с фосфат физиологичен разтвор, както е описано в Williams et al., (2016). Цекумът, включително съдържанието на цекума, и чернодробната тъкан бяха замразени в течен азот, последвано от съхранение при –80 ° C за иРНК, протеини, анализ на метаболитите и микробиота (за съдържание на цекум). Протоколите за изследване са одобрени от швейцарските кантонски ветеринарни органи на Во (лицензи 2257.0 и 2257.1).

Профилите на чернодробните метаболити са получени с помощта на масова спектрометрия по време на полет (ToF-MS) на Agilent 6550 QTOF в отрицателен режим при 4 GHz сканиране за характеристики между 50–1000 Da, използвайки протокола, както е описано от Fuhrer et al. (2011) [27].

Идентифицирани са 979 уникални метаболитни характеристики. От тях 699 са картографирани в специфичен метаболит въз основа на анотациите на базата данни на човешкия метаболом (HMDB), докато останалите 280 са картографирани в множество възможни енантиомери, както е описано [1]. Наборът от данни е достъпен в базата данни GeneNetwork.org (EPFL/LISP BXD Liver Polar Metabolites CD/HFD, 14 юни).

Следващо поколение секвениране на специфична за цекума микробна ДНК

Секумна секреция на имуноглобулин А (sIgA) ELISA

Статистически анализ

Ефектът от диетичните лечения върху телесното тегло и% телесни мазнини от BXD родителски линии, C57BL/6J и DBA/2J, и техните реципрочни F1 хибриди е тестван с помощта на линеен смесен модел в JMP Pro 13.1 с използване на щам, диета и щам x диета като фиксирани ефекти и клетка като произволен.

За да се постигне нормалност за данните за микробиома, които обикновено не са били разпределени, стойностите са били подложени на log 10 трансформации. За сравнения между две групи (CD-HFD сравнение) бяха проведени t-тестове на Student с корекция на Welch, докато тестовете на Kruskal-Wallis, последвани от множество сравнения на Dunn, бяха приложени за сравнения между повече от две групи (проби от щамове). Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Graph Pad Prism версия 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) и статистическия софтуер R версия 3.3.1 (https://www.r-project.org/).

Мъжете и жените, представляващи едни и същи родителски щамове (C57BL/6J и DBA/2J), не произхождат от обикновени клетки на майката и в рамките на щама полът не е представен напълно в множество клетки. Поради объркващи ефекти полът и клетката на майката са комбинирани като съвременен групов ефект (CG) в линеен модел (фиксиран ефект на щам и CG, вложени в щам).

Ефектът от диетата върху микробния профил на цекума на BXD също е тестван с помощта на линеен микс модел, като се използва диетата като фиксиран ефект и генетиката на щама като случайна. Ефектът от възрастта и реда на жертвоприношението беше тестван като ковариати и не беше установен значим при коригиране за многократно тестване.

Фенотипните корелации между бактериалния състав на цекума на ниво phyla и на рода, както е дефинирано по-горе, и чернодробните метаболити са оценени чрез корелации на Spearman rank.

QTL картографиране