1 Катедра по физиология, Midwestern University, 19555 N. 59th Avenue, Glendale, AZ 85308, САЩ

влияе

2 Катедра по анатомия, Аризонски колеж по остеопатична медицина, Midwestern University, 19555 N. 59th Avenue, Glendale, AZ 85308, САЩ

Резюме

1. Предистория

Забавеният стомашно-чревен транзит и забавеното време за изпразване на стомаха (гастропареза) са известни клинични усложнения, свързани с диабет и затлъстяване; всъщност гастропарезата се наблюдава при

30% от пациентите с диабет [1–4]. The ob/ob мишка с дефицит на лептин е често използван миши модел на диабет и затлъстяване, който имитира отблизо стомашно-чревната дисфункция, наблюдавана клинично, включително по-бавен стомашно-чревен транзит и забавено време за изпразване на стомаха [2, 5].

Механизмите, участващи в посредничеството при дисфункционален стомашно-чревен транзит при модели на мишки с диабет са сложни и по-малко разбрани. В това проучване ние предоставяме оценка на ефектите на диетата с генистеин върху подвижността и свиваемостта на йеюнума, дебелината на стената на йеюнума и количествено определяне на ацетилхолиновите рецептори (AChR) в ob/ob мишка йеюнум. Предположихме, че диабетикът е със затлъстяване ob/ob мишката има дисфункционална подвижност на йеюнума, заедно с понижаване на регулацията на AChR и че тези недостатъци могат да бъдат подобрени чрез прилагането на диета с генистеин за период от 4 седмици.

2. Методи

Жени ob/ob и постни мишки C57BL/6J на възраст 5 седмици бяха закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME) и настанени в център за грижи за животни с 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Мишките бяха разпределени на случаен принцип към една от двете диетични групи: хранени или със стандартна гризачка за гризачи (std), или с диета, съдържаща генистеин (Gen). Диетата, съдържаща генистеин (Gen), е закупена от Dyets Inc. (Bethlehem, PA) и съдържа 600 mg генистеин/kg диета. Съставът на диетата с генистеин е публикуван по-рано [9, 13, 14]. Храната и водата бяха осигурени по желание. Телесното тегло и общото здравословно състояние се наблюдават ежеседмично по време на 4-седмичния период на диета. В

10-На 12-седмична възраст мишките (ob/ob и постно) бяха задушени в атмосфера от 100% CO2, последвано от хирургичен пневмоторакс. Грижите за животните се провеждаха в съответствие с установените насоки и всички протоколи бяха одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета в Средния Запад.

2.1. Хистология и морфология: H&E оцветяване

Прясно изолирани парчета от йеюнума бяха вградени и светкавично замразени в съединение за оптимална температура на рязане (OCT, Tissue-Tek, Torrance, CA). За оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E), замразени нарязани секции на йеюнума (10 μм) са оцветени със стандартен протокол, преди да се извършат морфометричните анализи за оценка на основните хистологични измервания. Накратко, секциите бяха изложени на следните протоколи за измиване: хематоксилин 30 s, изплакване с вода 10 s, разтвор на Scott 5 s, изплакване с вода 10 s, 95% етанол 5 s, еозин 15 s, изплакване с 95% етанол 10 s и след това 100% етанол 10 s, последван от ксилол 15 s. Дебелината на вътрешната кръгла гладка мускулна стена (и броят на ядрата в тази област), дебелината на външната надлъжна стена (и броят на ядрата в тази област) и общата дебелина на стената са измерени с помощта на Axiovision (Carl Zeiss), от изображения на H & E- оцветени секции на йеюнума. Всички изображения са направени при 10-кратно увеличение. Средните стойности на измерванията са взети от 5 отделни филийки на замразена част от йеюнума (т.е. на мишка) и данните са представени като средната стойност на множество мишки на група.

2.2. Имунофлуоресценция на ацетилхолинов рецептор (AChR)

AChR се визуализират, както е описано по-рано [15], с флуоресцентен микроскоп чрез свързването на α-бунгаротоксин, конюгиран с тетраметилродамин. Раздели на йеюнума (10 μм) са инкубирани в токсинсъдържащата среда за 30 минути при 37 ° С, за да се маркират AChRs. След това секциите бяха изплакнати два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), фиксиран за 10 минути с 2% параформалдехид при стайна температура в PBS, изплакнати два пъти с PBS със стайна температура, дехидратирани в студен метанол за 5 минути при -20 ° C и монтиран в буфериран глицерол, съдържащ парафенилендиамин. Наблюдавани са ярки клъстери на AChR и са определени средни клъстери на зрително поле за 3-4 произволно избрани полета на животно. Флуоресцентни и фазово контрастни изображения са заснети от флуоресцентния микроскоп на Olympus с цифровия фотоапарат Magnafire, използвайки 20x обектив.

2.3. Мерки за съкратимост

В подгрупа от мишки бяха приготвени прясно изолирани йеюнумови пръстени за измерване на изометрично напрежение. Всяка мишка даде 2 пръстена тъкан от йеюнум. Всички сегменти на йеюнума бяха подложени на едни и същи процедури и данните бяха осреднени и считани за представителни за това животно, считани

. Изометричното напрежение беше измерено с помощта на стандартни процедури за изолирана тъкан. Накратко, йеюнумовите пръстени бяха монтирани между 2 жици от неръждаема стомана, които бяха преминали през лумена на всеки иеюнум пръстен, с проводници, свързани към преобразувател на сила (159901A, Radnoti, Monrovia, CA). Пръстените на Jejunum бяха потопени в баня от 15 ml, съдържаща бикарбонатен звънец на Krebs, в mM: 115 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1.2 MgCl2 и 1.2 CaCl2 (pH 7.4) и уравновесени при 37 ° C с 95% кислород/5% смес от въглероден диоксид газ. Пръстените на йеджунума бяха опънати и поддържани при

0,275 g напрежение в покой и уравновесено за

40 минути с честа смяна на баня. Получават се криви на доза-отговор на напрежение, генерирани чрез кумулативно добавяне на нарастващи концентрации на калиев хлорид (с устойчиви съкратителни отговори, постигнати при всяка доза, 0-100 mM). Развитието на напрежението непрекъснато се записва и събира от PowerLab със софтуера за компютърна система за събиране на данни ChartPro (AD Instruments Inc., Колорадо Спрингс, Колорадо).

2.4. Мерки за стомашно-чревна подвижност
2.5. Химикали

Антитела за AChR-бунгаротоксин, конюгирани с тетраметилродамин, са закупени от Molecular Probes (Life Technologies, Carlsbad, CA). Всички други химикали са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури).

2.6. Статистика

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Числата в скоби представляват броя на тъканите, използвани от отделни отделни мишки. Несдвоени т-тестовете бяха извършени с помощта на GraphPad (Сан Диего, Калифорния) и

се счита за статистически значима.

3. Резултати

The ob/ob женски мишки, хранени със стандартна диета (51,50 ± 1,55 g,

) са били 2,2 пъти по-тежки от слабите аналози (23,67 ± 0,43 g,), а диетата с генистеин предизвиква 12% загуба на тегло при ob/ob жени (45,57 ± 0,93 g,).

3.1. Контрактилитет

Напрежението, генерирано в прясно изолирани сегменти на йеюнума, беше измерено за всяка група мишки (Фигура 1). Контрактилитетът се увеличава във всички женски групи като функция на постепенно увеличаване на дозата на калиев хлорид (10–100 mM) в йеюнума (Фигура 1). Максималното напрежение, генерирано със 100 mM KCl, беше сравнимо в ob/ob стандартно хранени мишки (0,60 ± 0,05 g,

) в сравнение с постно управление (0,75 ± 0,07 g,). Няма ефект от диетата с генистеин върху максимално генерираното напрежение (0,60 ± 0,11 g,

). Напрежението в почивка не се различава между никоя от групите при жените (Фигура 1: постно стандартно хранене = 0,28 ± 0,03 g,; ob/ob стандартно хранене = 0,27 ± 0,02 g,; и ob/ob хранене с генистеин = 0,26 ± 0,02 g,). Мокрото тегло на всеки сегмент на йеюнума не се различава между групите; постно стандартно хранене = 41,16 ± 2,75 mg (), ob/ob стандартно хранене = 49,23 ± 3,44 mg (), и ob/ob подаване на генистеин = 49,79 ± 3,36 m ().


3.2. Морфология на йеджунума

За да се определи дали морфологията на йеюнума е модифицирана от диабет и за да се установи дали диетата с генистеин може да модифицира дебелината на стената, хистологичните срезове бяха оцветени с помощта на H&E и анализирани за обща дебелина на стената, кръгла дебелина на гладката мускулатура, надлъжна дебелина на гладката мускулатура и брой ядра на гладка мускулен слой (Фигура 2). Няма промени в нито един от измерените параметри.


. Вътрешна кръгла дебелина на гладката мускулатура.

. Брой ядра в рамките на вътрешния кръгов гладкомускулен слой.

. Дебелина на външната надлъжна гладка мускулна стена.

. Брой ядра в външния надлъжен гладкомускулен слой.

. Стойностите са средни стойности ± SEM.

3.3. Ацетилхолинови рецептори

AChRs се визуализират и определят количествено при всички групи мишки (Фигура 3). AChRs са значително намалени с 48% в ob/ob женски мишки (43,75 ± 4,76,) в сравнение със слаби аналози (84,10 ± 7,19, Фигура 3). Интересно, ob/ob мишки, хранени с диестеинова диета, са имали 1,48-кратно значително увеличение (64,82 ± 7,21,) в общия брой на AChRs в сравнение с ob/ob женски контролни партньори, хранени със стандартна диета (43,75 ± 4,76,); т.е. диетата с генистеин частично, но съществено, спаси броя на AChRs (Фигура 3). В допълнение, определихме количествено броя на AChRs на 100 μm дължина на вили, за да се нормализира за промени в дължината на вили между групите: AChRs са значително намалени в ob/ob мишки (0.84 ± 0.18,) в сравнение с наклонени (2.31 ± 0.31, Фигура 3), а диетата на генистеин предизвика значително спасяване на AChR клъстери (2.26 ± 0.39, Фигура 3).


). * Значителна разлика от постно,

. # Значителен генистеин-медииран ефект,

3.4. Подвижност

Характеристиките на подвижността бяха определени с помощта на системата за заснемане на видео GIMM. Пример за следа, записана с помощта на тази система за оценка на подвижността, е показана на Фигура 4.


Не открихме ефект на диабет (или генистеин) върху скоростта, разстоянието, времето или броя на събитията в изолирани сегменти на йеюнума (Фигура 5). Ние обаче отбелязваме значително увеличение на разстоянието между събития в диабетична йеюнум (7,33 ± 0,99,) спрямо слаби контроли (3,95 ± 1,04, Фигура 5), без ефект на генистеин (6,32 ± 0,42,).


Значителна разлика от постно,

4. Дискусия

Диабетикът ob/ob модел на мишка е с липса на лептин и хиперфагичен, с наднормено тегло и резистентност към инсулин [16]. Предимството на този модел на диабета е наблюдението, че чревни затруднения, които приличат на клинично наблюдаваните при диабет (т.е. забавен стомашно-чревен транзит [2] и забавено изпразване на стомаха [3]), също се отбелязват в ob/ob модел. The ob/ob мишки, използвани в настоящото проучване (12-13 седмици) са сравними с предишни проучвания, демонстриращи променена чревна функция заедно с типичните симптоми на диабет за този възрастов диапазон. При мъжете ob/ob мишки (на възраст 6–15 седмици) или мъжки мишки C57Bl/6J, хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 14 седмици, е доказано, че гастропарезата е свързана с двойно повишаване на нивата на глюкоза в плазмата [6, 17]. За отбелязване е, мъж на 15 седмици ob/ob е показано, че мишките показват забавен стомашно-чревен транзит, корелиран с повишено съдържание на дуоденален секретин и намалено съдържание на вазоактивен чревен пептид в дебелото черво [2, 18]. В допълнение, Kiely et al. [19] са показали, че мъж на възраст 13-14 седмици ob/ob мишки показват забавено транзитно време на стомашно-чревния тракт.

Патогенезата на забавения диабетно стомашно-чревен транзит не е добре разбрана и настоящите доказателства в тази област показват сложна етиология. При диабетни db/db мишки нарушената стомашно-чревна подвижност се дължи на намалените области на интерстициалните клетки на Cajal [20]. Забавеният стомашно-чревен транзит при затлъстели мишки с диабет е свързан със загуба на дуоденален секретин и номер на серотонинови клетки в дебелото черво [2]. Тънките черва, по-специално йеюнумът, остава недостатъчно проучен регион при модели на диабет и затлъстяване. Нашите резултати показват значителни промени при жените ob/ob миши йеюнум, които са в съответствие с дисфункционален чревен транзит: (1) намалени клъстери на AChR и (2) увеличено разстояние между последователните съкратителни събития. Тези данни комбинират, че структурните промени и/или промени в експресията на протеини вероятно допринасят за увеличено транзитно време на стомашно-чревния тракт и по този начин допринасят за диабетичния фенотип на този модел.

Нашите данни показват, че докато общата дебелина на стената не е била променена с диабет, нито дебелината на вътрешния кръгъл гладък мускул, нито външната надлъжна гладка мускулатура са били променени (Фигура 2). Освен това диетата с генистеин не променя броя на ядрата, което показва липса на хипер- или хипотрофия на гладкомускулните клетки в стените на стомашно-чревния тракт. По този начин в ob/ob женска мишка йеюнум, физическите модификации на гладката мускулатура не могат да обяснят нито забавения чревен транзит на този диабетен модел, нито благоприятните ефекти от диетата на генистеин върху него. Интересното е, че общата максимална контракция, генерирана в изолирани пръстени на йеюнума, е сравнима между тях ob/ob жени и слаби колеги (Фигура 1). Въпреки това, при липса на зависими от рецептора мерки за съкратимост, с агонисти като ацетилхолин, понастоящем не могат да се правят всеобхватни и механистични заключения.

Използването на системата за наблюдение на стомашно-чревната подвижност (GIMM) ни дава възможност да определяме различни параметри, свързани с присъщата съкратителна природа на изолираните сегменти на йеюнума. В тази подгрупа от експерименти ние непрекъснато анализирахме подвижността за поне една минута от записа и оценихме следното (Фигури 4 и 5): скорост, разстояние, време, брой събития и разстояние между събития. До този момент системата GIMM е ефективно използвана за анализ на пропулсивна подвижност през тъкани на дебелото черво [25, 26]. Не са ни известни други изследвания, използващи тази методология за оценка на подвижността на тънките черва при миши модели. Ние вярваме, че прилагането на тази техника върху миши модели на чревна патология ще хвърли светлина върху участието както на контрактиращи, така и на релаксиращи агенти, които водят до чревна дисмотилитет. Нашите бъдещи проучвания ще бъдат насочени към оценка на фармакологичните инструменти за намаляване на разстоянието между последователните съкратителни събития през ob/ob черва на мишката (т.е. връщане към слаби нива).

Времето за преминаване през червата е свързано с ефективно усвояване на хранителни вещества в червата. Предположението, че по-дългите транзитни времена са пряко свързани с повишената абсорбция и по-голямото наддаване на тегло изглежда логично, но вероятно е по-сложно. Всъщност е доказано, че пациентите със затлъстяване имат повишена абсорбция в тънките черва заедно с по-кратко време за преминаване [27]. Това е допълнително потвърдено в проучвания на изолирани резецирани тънки черва, при които е доказано, че индуцираната от карбахол контрактилитет на гладката мускулатура е увеличена и свързана с по-бързото транзитно време [28]. По този начин изобилие от нерегулирани пътища вероятно участва в представянето на чревна дисфункция в модела на диабетна мишка и при пациенти.

5. Заключения

В заключение, това проучване демонстрира два механизма, които могат да бъдат отговорни за забавения стомашно-чревен транзит през ob/ob миша йеюнум. Предполагаме, че тази дисфункция при чревния транзит се дължи на комбинация от намален брой AChR и увеличено разстояние между последователните съкратителни събития. Тази двойка от несъответствия вероятно допринася за забавеното транзитно време на стомашно-чревния тракт, типично за ob/ob мишка и може също да обясни човешкия диабетно чревен синдром. Освен това демонстрираме, че диетата с генистеин значително възстановява броя на AChRs, като ги доближава до нивата, наблюдавани при постно управление, и докато диестаиновата диета не намалява значително разстоянието между последователните съкратителни събития, със сигурност има тенденция да се прави това. Бъдещите проучвания ще имат за цел да разберат по-добре дали клетъчните регулатори на AChR и/или други невромодулатори също са променени в ob/ob мишки. Предполагаме, че подобряването на тези чревни дисфункции може да осигури метод за терапевтично облекчаване на стомашно-чревните усложнения, наблюдавани при диабетния фенотип.

Съкращения

AChR:Ацетилхолинов рецептор
PBS:Буфериран с фосфат физиологичен разтвор
ОКТ:Смес за оптимална температура на рязане
ТОЙ:Хематоксилин и еозин
GIMM:Система за наблюдение на стомашно-чревната подвижност.

Достъп до данни

Наборите от данни, използвани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.

Етично одобрение

Грижите за животните се провеждаха в съответствие с установените насоки и всички протоколи бяха одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета в Средния Запад.

Конфликт на интереси

Авторите заявяват, че нямат конкуриращи се интереси.

Приноси на авторите

Всички автори допринесоха значително за концепцията и дизайна на изследването, експериментални процедури, анализ, интерпретация на данните, писане и редактиране на ръкописи и одобрение на представената версия.

Благодарности

Авторите биха искали да благодарят на г-жа Kelly Ezell за техническа помощ, свързана с количественото определяне на AChR, и на г-жа Lana Leung за техническа помощ, свързана с оцветяването на AChR. Робърт Долан и Шон Катмъл бяха подкрепени от програмата за летни стипендии на Университета в Средния Запад. Тази работа беше подкрепена от Интрамурални фондове на Университета на Средния Запад (за Layla Al-Nakkash), Програма за изследване на соевото здраве (за Layla Al-Nakkash) и Фондация за образование и изследване на диабета (за Layla Al-Nakkash).

Препратки