AJ FitzGerald

† Катедра по хистопатология, Отдел за научни изследвания, Медицински факултет на Imperial College, болница Хамърсмит, DuCane Road, Лондон W12 ONN, Великобритания

RC Evans

* Катедра по медицина, Университет в Ливърпул, Ливърпул L69 7ZA, Великобритания

R Сингх

* Катедра по медицина, Университет в Ливърпул, Ливърпул L69 7ZA, Великобритания

Дж. М. Роудс

* Катедра по медицина, Университет в Ливърпул, Ливърпул L69 7ZA, Великобритания

RA Goodlad

† Катедра по хистопатология, Отдел за научни изследвания, Медицински факултет на Imperial College, болница Хамърсмит, DuCane Road, Лондон W12 ONN, Великобритания

‡ Хистопатологично отделение, Cancer Research UK, 44 Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PX, UK

Резюме

Лектините са протеини или гликопротеини с неимунен произход, които се свързват специфично с въглехидратните структури. Те са широко разпространени в човешката диета и много от тях са устойчиви на храносмилането. Доказано е, че високите дози лектини стимулират растежа на червата и панкреаса. Целта на настоящото изследване е да изследва дългосрочните действия на ниски дози лектини върху червата и панкреаса на плъховете. Проведено е дългосрочно проучване за канцерогенеза, като се използват ниски нива (40 µg/плъх/ден) на фъстъци (PNA) или гъби лектин (ABA), които се свързват с О-свързани (тип муцин) олигозахариди в червата. Макар това да е проектирано основно като проучване за канцерогенеза на дебелото черво, е изследван и панкреасът. Не се наблюдават значителни промени в канцерогенезата на дебелото черво, но дебелото черво е малко по-тежко в групите, лекувани с лектин. Теглото на панкреаса е значително по-голямо (с 18 и 23%) и в двете групи, лекувани с лектин (Р Ключови думи: панкреас, стомашно-чревен тракт, клетъчно делене, лектин, фъстъчен аглутинин, гъбен аглутинин

Въведение

Нормалната човешка диета съдържа много лектини (протеини или гликопротеини с неимунен произход, които имат специфичност за въглехидратните структури) (Pusztai 1993, Nachbar & Oppenheim 1980). Въпреки че има значителна литература за ефектите върху червата на токсични лектини като червен боб (PHA) (Pusztai et al. 1982) и аглутинин от пшеничен зародиш (WGA) (Brady et al. 1978), по-малко се знае за ефектите на нецитотоксични лектини. Няколко фактора предполагат, че такива погълнати лектини могат да имат основен ефект върху пролиферацията и метаболизма на човешкото черво. Например: (i) много лектини, особено тези от растителен произход, са плътно кълбовидни и по този начин силно устойчиви на протеаза и са в състояние да оцелеят при преминаване през червата на бозайниците без смилане (Barondes et al. 1994) (ii) гликокаликс на чревната лигавица има многобройни и разнообразни потенциални места за свързване на лектини (Weaver & Bailey 1987) (iii) е доказано, че повечето лектини имат значителни биологични ефекти върху клетките, с които се свързват (Kaplowitz 1985).

Една такава група лектини се свързва с галактоза β1–3 N-ацетилгалактозамин α– (Galβ1–3GalNAc (α -), антигенът на кръвната група на Thomsen Friedenreich (TF), който е основната структура от тип I върху O-свързания (тип муцин) олигозахариди. Тази структура може да бъде изразена не само чрез секретирани муцини (Melchior & Gerace 1995), но и чрез гликоконюгати на повърхността на епителните клетки (Campbell et al. 1995).

Досега е установено, че всички TF-свързващи лектини, идентифицирани в растенията, са нецитотоксични и включват съставки на различни хранителни източници, които включват фъстъци и гъби. Фъстъченият лектин има пролиферативни ефекти върху клетъчните линии на дебелото черво (Ryder et al. 1992) и върху биопсиите на лигавицата на човешкото дебело черво в културата (Ryder et al. 1994). Добавянето на 100 g фъстъци на ден в продължение на една седмица към нормална диета причинява 40% увеличение на митотичния индекс на ректалната лигавица при хора (пациенти със синдром на раздразнените черва, но с нормална хистология на дебелото черво), които експресират лектиновия рецептор в ректалната си лигавица (Ryder et ал. 1998). Друга група е демонстрирала пролиферативен ефект на погълнатия фъстъчен лектин върху тънките черва на мишки (Henney et al. 1990) и ние също сме показали изразени ефекти на PNA както върху тънките, така и върху дебелото черво на плъхове (Jordinson et al. 1999).

Обратно, установихме, че TF-свързващият лектин от ядливата гъба (Agaricus bisporus, ABA) инхибира пролиферацията в широк спектър от епителни клетки без очевидна цитотоксичност (Yu et al. 1993) и също така инхибира инвазията на HCT116 ракови клетки на дебелото черво чрез колагенови гелове (Yu et al. 1999). ABA се различава по своята специфичност от фъстъчен лектин, свързващ се също със сиалил-Galβ1–3GalNAcα– (сиалил TF).

В допълнение към ефекта им върху червата, наскоро съобщихме, че някои лектини, особено фъстъчен лектин, могат да повишат нивата на плазмения холецистокинин (CCK) и също така да увеличат теглото на панкреаса (Jordinson et al. 1999). Такива ефекти могат да възникнат и от кръвоносните лектини, тъй като фъстъченият лектин може да бъде открит в кръвта на хората минути след ядене на фъстъци (Wang et al. 1998), а системното вливане на фъстъчен лектин в плъхове може да стимулира делението на дебелото черво (Jordinson et al . 2000).

Съществуват значителни географски разлики в честотата на рак на панкреаса (Warshaw & Fernandez-del Castillo 1992). В САЩ и във Великобритания заболеваемостта рязко се е увеличила от 30-те години на миналия век, но изглежда, че е на плато от 70-те години на миналия век. В Япония се наблюдава по-скорошно увеличение от 1,8 на 100000 през 1960 г. до 5,2 през 1985 г. (Hirayama 1989). Причините за тези изразени географски разлики са неясни, но забележимото нарастване на честотата от 40-те години на миналия век в западните страни предполага, че факторите на околната среда са много важни. Диетичните рискови фактори изглеждат подобни на рака на дебелото черво с някои доказателства в подкрепа на високия прием на месо или мазнини като рискови фактори с плодове и зеленчуци като защитни фактори (Farrow & Davis 1990) (Norell et al. 1986) (Howe & Burch 1996 ). Доказателствата за тези диетични фактори обаче се считат за по-слаби от тези за тези с рак на дебелото черво (Warshaw & Fernandez-del Castillo 1992). Малко се знае за възможните роли на растителните лектини при рак на дебелото черво и панкреаса, но способността им да променят клетъчната пролиферация изисква тяхното разследване.

Настоящият доклад докладва нашите открития за растежа на панкреаса след хранене с лектин. Данните са генерирани като част от проучване, предназначено основно да изследва чревната пролиферация и канцерогенезата. Плъховете са третирани с канцероген диметилхидразин на дебелото черво, но резултатите от червата са неубедителни; многофакторният дизайн на изследването обаче ни позволи да изследваме действията върху панкреаса с ефективна статистическа мощ.

Материали и методи

Използвани са седемдесет и два мъжки плъха Wistar, на възраст между 6 и 8 седмици и със средно тегло (213.0 ± 3.6 g). Те бяха поставени в една от шестте следващи групи; контролна група, DMH група, фъстъчена лектинова група, гъбена лектинова група, DMH плюс фъстъчена лектинова група и DMH плюс гъбена лектин. След две седмици на диети, плъховете след това получават 16 седмични подкожни инжекции или на DMH (1,2-диметилхидразин, Sigma Poole, Дорсет, Великобритания) в доза 20 mg/kg телесно тегло (n = 36), или същия обем на превозното средство (n = 36; 1 ml/kg телесно тегло) (Park etal. 1997). Лектинът от фъстъци и гъби е закупен от EY Laboratories, Лестършир, Великобритания.

Диетата се основава на стандартна чау-чау (приготвена от SDS, Witham, Essex, UK), към която се добавят 2 mg/kg PNA или ABA, след което диетата се гранулира и облъчва.

Плъховете са имали свободен достъп до храна и вода и са били убити от C02 и цервикална дислокация, 6 седмици след последната инжекция на DMH и 24 седмици след първата инжекция на DMH.

Всички животни бяха държани в контролирана от температурата стая с 12: 12 часа цикъл светлина-тъмнина. Храната и водата се предлагаха ad libitum и животните се претегляха ежеседмично. Всички експерименти с животни са одобрени от етичния комитет на Cancer Research UK Animals и от Закона за животните на Министерството на вътрешните работи (1986 г.).

Цели панкреати бяха разчленени, претеглени и фиксирани с формалин. Първите шест панкреаса от всяка група бяха използвани за количествено стереологично изследване (Howard et al. 1997). Чрез използване на стереология могат да бъдат постигнати значителни промени от около 1/10 от величината на тези, които могат да бъдат открити чрез качествени методи (Howard et al. 1998).

Pancreata бяха взети равномерно на случаен принцип (Gundersen & Jensen 1987) и взети „вертикални“ блокове (Baddeley et al. 1986), вградени в Historesin (TAAB Laboratories Equipment Ltd, Aldermaston, Berkshire, UK) и разделени на 5 µm и 30 µm. Абсолютният обем и обемната фракция на островната тъкан, ацинарната тъкан и преградната тъкан в панкреаса се изчисляват чрез преброяване на точки и метода Cavalieri (Howard et al. (1998).

статистически анализи

Всички резултати са представени като групова средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Извършен е двупосочен вариационен анализ (anova), за да се тества какъвто и да е ефект на лектин или DMH и всякакви взаимодействия между тях. Ако не е имало взаимодействие, тестът се пуска отново без термина за взаимодействие. Анализът беше извършен с помощта на статистически софтуер Minitab, издание 10.5 Xtra (Minitab Ltd, Ковънтри, Великобритания).

Резултати

стимулират

Ефекти на лектините от фъстъци и гъби върху масата на ацините и преградите на панкреаса. Данните бяха тествани чрез двупосочен анализ на ковариацията и значимите ефекти са представени на фигурата.

Дискусия

Основната цел на изследването беше да се изследват действията на двата лектина върху стомашно-чревната канцерогенеза, за съжаление резултатите за това бяха неубедителни. Независимо от това, откриването на тумор в групата, хранена с PNA, която не е лекувана с DMH, е източник на безпокойство и в ход са допълнителни проучвания за действията на PNA в моделите на канцерогенеза. Въпреки че имаше индикация за повишена стомашно-чревна тъканна маса, особено при PNA, това не беше значително, но двата лектина значително увеличиха теглото на панкреаса. Тези резултати са статистически значими въпреки относително ниската доза използван лектин.

Данните за теглото бяха увеличени чрез използването на стереологични техники, които са важни инструменти за изследване на целия панкреас, предоставяйки обективна оценка на отделните обеми на всеки компонент на панкреаса, без да е необходимо да се реконструира серийно панкреасът. Наблюдава се значително и значително значително увеличаване на теглото на панкреаса и теглото на панкреатичните ацини и прегради и в двете групи, хранени с лектин, това е по-забележителното предвид много ниската доза лектин, използвана. Con-A, PHA, WGA и PNA могат да увеличат теглото на панкреаса, когато се прилагат в големи дози (25 mg/плъх/ден) за кратки периоди (Jordinson et al. 1999). Фъстъците обикновено съдържат около 1 mg/g PNA (Lotan et al. 1975), като по този начин 250 g плъх, ядещ 40 µg на ден, би поел 160 µg/kg, приблизително еквивалентно на 70-килограмов мъж, който яде 11 g фъстъци на ден. Има 100 микрограма ABA на грам гъба (Sueyoshi et al. 1985), като по този начин дозата е приблизително еквивалентна на 110 g (една порция) гъби на ден.

Тези трофични действия могат да бъдат преки или поради непряк механизъм. Действията на PNA и ABA могат да бъдат директни, тъй като някои лектини могат да се абсорбират и транспортират в кръвта. Въпреки че лектините са добре известни, че аглутинират червените кръвни клетки, PNA се аглутинира само ако остатъците от сиаловата киселина се отстранят, за да разкрие криптичния TF антиген. Други лектини могат да се свързват с плазмените протеини и по този начин да не аглутинират еритроцитите. Неотдавнашно проучване показа, че фъстъченият лектин се открива в кръвта на човека скоро след ядене на фъстъци (Wang et al. 1998), а системната инфузия на фъстъчен лектин в плъхове може да стимулира клетъчното делене в дебелото черво (Jordinson et al. 2000). Не е известно как тези лектини навлизат в кръвта, но възможен път е чрез свързване към свързания с фоликула епител на чревните М клетки (Clark et al. 1995), но скоростта на усвояване (Wang et al. 1998) предполага че е включен и стомахът.

Алтернативен механизъм за действията на тези агенти може да бъде осигурен от констатацията, че няколко лектини (включително PNA и ABA) могат да взаимодействат с рецептора на епидермалния растежен фактор, може би чрез нарушаване на страничната подвижност и агрегация на митоген-рецепторни комплекси (Kaplowitz 1985) (Zeng et al. 1995). Райдър обаче (Ryder et al. 1992) не открива конкуренция между PNA и EGF; всъщност изглежда, че има синергично действие на PNA и EGF, когато се дава на експланти на дебелото черво.

Значението на тези промени все още е неизвестно, но експерименталният рак на панкреаса постоянно се насърчава от агенти, които индуцират панкреатична хиперплазия. Смята се, че много от тях, включително сурово соево брашно, предизвикват панкреатична хиперплазия, медиирана чрез освобождаване на CCK от дванадесетопръстника. Част от соевия ефект може да се отдаде на соевия лектин (и други лектини), взаимодействащ с все още неидентифициран рецептор върху лигавицата на дванадесетопръстника, с произтичащо освобождаване на CCK (Jordinson et al. 1996). Соевият лектин лесно се инактивира с топлина, а суровата соя не е част от човешката диета, така че това е малко вероятно да бъде важен стимулатор на рак на панкреаса при човека. Това обаче повишава възможността други диетични лектини, особено тези, които са устойчиви на топлина и храносмилане, да имат подобни ефекти върху освобождаването на холецистокинин и следователно панкреатична хиперплазия.

Ако тези лектини също стимулират растежа на панкреаса при хората, това би означавало, че консумацията на фъстъци (и вероятно на други устойчиви на топлина и храносмилане диетични нецитотоксични галактоза-свързващи диетични лектини) може да насърчи рака на червата и панкреаса. Независимо от това, много специфичното свързване на тези лектини също може да осигури потенциално средство за подобряване на такива действия. Няколко диетични фибри, особено тези от зеленчуци, са с високо съдържание на остатъци от галактоза, което увеличава интригуващата възможност тези влакна да се свържат и по този начин да „дезактивират“ лектина. Това би предоставило алтернативно обяснение за защитните действия на някои влакна, докладвани в епидемиологични проучвания, при които консумацията на (съдържащи галактоза) плодови и растителни влакна е свързана с намален риск от рак. Възнамеряваме да следваме тази хипотеза в червата и панкреаса в по-нататъшни проучвания, използващи експериментални модели на рак на панкреаса.

В заключение показахме, че два лектина могат да променят растежа на панкреаса in vivo. Това се постига с помощта на ниски дози лектини, които лесно могат да се появят при нормална диета. Това има тревожни последици, тъй като увеличеният растеж може да бъде стимулатор на канцерогенезата.

Благодарности

Благодарим на Съвета за изследвания на биотехнологиите и биологичните науки за финансирането на Anthony FitzGerald & Ravinder Singh.