Ирина Третякова

1 Медиген, Фредерик, Мериленд

Джейсън Хърн

1 Медиген, Фредерик, Мериленд

Ерю Уанг

2 Sealy Center за разработване на ваксини и Катедра по патология, Институт за човешки инфекции и имунитет, Медицински клон на Университета в Тексас, Галвестън, Тексас

Скот Уивър

2 Sealy Център за разработване на ваксини и Катедра по патология, Институт за човешки инфекции и имунитет, Медицински клон на Университета в Тексас, Галвестън, Тексас

Петър Пушко

1 Медиген, Фредерик, Мериленд

Резюме

Заден план. Вирусът Chikungunya (CHIKV) причинява огнища на чикунгуня треска по целия свят и представлява възникваща пандемична заплаха. Разработването на ваксина срещу CHIKV се оказа предизвикателство. Понастоящем няма одобрена ваксина или специфична терапия за заболяването.

Методи. За да разработим нова експериментална CHIKV ваксина, използвахме нова имунизационна ДНК (iDNA) инфекциозна клонираща технология, която съчетава предимствата на ДНК и живи атенюирани ваксини. Тук ние описваме iDNA ваксина, съставена от плазмидна ДНК, която кодира инфекциозния геном с пълна дължина на жив атенюиран CHIKV клон 181/25 надолу по веригата от еукариотния промотор. Подходът iDNA е проектиран да инициира репликация на жив ваксинен вирус от плазмида in vitro и in vivo.

Резултати. Експериментални CHIKV iDNA ваксини бяха приготвени и оценени в култивирани клетки и при мишки. Трансфекцията с 10 ng iDNA беше достатъчна за започване на репликация на ваксинен вирус in vitro. Ваксинирането на мишки BALB/c с единични 10 μg CHIKV iDNA плазмид доведе до сероконверсия, предизвикване на неутрализиращи антитела и защита от експериментално предизвикателство с невровирулентен CHIKV.

Заключения. Живата атенюирана ваксина CHIKV 181/25 може да се достави in vitro и in vivo чрез използване на ДНК ваксинация. Изглежда, че подходът iDNA представлява обещаваща ваксинационна стратегия за CHIK и други алфавирусни заболявания.

МЕТОДИ

Клетъчни линии и вируси

Клетъчни линии на китайски хамстер (CHO) и африканска зелена маймуна Vero са получени от Американската колекция за типови култури (ATCC; Manassas, VA) и се поддържат в овлажнен инкубатор при 37 ° C и 5% CO2 в α минимална съществена среда (αMEM) допълнено с 10% фетален говежди серум (FBS) и гентамицин сулфат (10 μg/mL) (Life Technologies, Carlsbad, CA). Щамът CHIKV 181/25 жива атенюирана ваксина TSI-GSD-218 е получен от Световния референтен център за нововъзникващи вируси и арбовируси (WRCEVA). Невровирулентният щам Ross на CHIKV е стандартен изпитателен запас, използван за предизвикване на мишки в лабораторията за ниво на биобезопасност 3+ (BSL3 +) в Медицинския клон на Университета в Тексас в Галвестън [22].

Плазмиди и подготовка на iDNA

инициира

Секвениране и подготовка на сДНК клонинги с пълна дължина и плазмиди на имунизационна ДНК (iDNA). A, Последователен полиморфизъм при остатъци 301 и 304 в неструктурния полипротеин (nsP). Само клон 3.5–40 има последователност, идентична на последователността на TSI-GSD-218 181/15 ваксина (GenBank> L37661), докато други клонове и последователности GenBank съдържат вариации на тези остатъци. Номерата за присъединяване към GenBank са показани вдясно. В, Показани са плазмиди, кодиращи функционалната ДНК на пълната дължина на чикунгуня вирус (cDNA). Посочени са промотор на цитомегаловирус (CMV) (отворена стрелка), промотор 26S (плътна стрелка), рестрикционни сайтове, използвани за сглобяване на клонове с пълна дължина cDNA, и гени за устойчивост на антибиотици, както и обозначения на iDNA плазмидите. Amp, ампицилин; Кан, канамицин.

Трансфекции и анализи In vitro

CHO или Vero клетките се трансфектират чрез електропорация на плазмидна iDNA при концентрации, вариращи от 1 ng до 5 μg. Трансфекцията както на CHO, така и на Vero клетки се извършва по същество, както е описано по-горе [21, 23]. Като контроли клетките бяха инкубирани с 10 2–10 5 плакообразуващи единици (PFU) на ваксинален вирус CHIKV 181/25. Експресията на CHIKV антигени в iDNA-трансфектирани и заразени с вируси клетки се открива чрез имунофлуоресцентен анализ (IFA) и Western blot, като се използва CHIKV хиперимунна миши асцитна течност (HMAF) VR-1241AF (ATCC). CHIKV антигените също са потвърдени чрез Western blot, като се използва реконвалесцентен човешки антисерум (UTMB; с любезното съдействие на д-р Робърт Теш). И накрая, наличието на вирус в растежната среда беше потвърдено чрез анализ на плаки в дубликати. Бяха определени средни стойности и SD. Всеки експеримент е направен поне 2 пъти, за да се осигури възпроизводимост на резултатите. За кривите на растежа на вируса пробите се събират на определени интервали и се определят количествено в два екземпляра чрез анализ на плаки в монослоеве Vero клетки в 6-ямкови плаки.

Имунизации и серологичен анализ

Предизвикателство

За експериментално предизвикване мишките бяха прехвърлени в съоръжението BSL3 +, описано по-горе, и предизвикани с вирулентен щам CHIKV Ross в доза 6 × 10 6 PFUs в 20 μL по интраназален път [22]. Кръвни проби се събират в продължение на 3 дни след предизвикване за откриване на виремия. Статистическата значимост на разликите в титрите на вируса между ваксинираните и контролните животни се определя чрез тест на Student.

РЕЗУЛТАТИ

Получаване на CHIKV p181/25 iDNA

CHIKV живата атенюирана ваксина TSI-GSD-218, клон 181/25, се предава веднъж в клетки CHO. Вирусна РНК се изолира от вирус 1 на пасаж и се използва за приготвяне на CHIKV кДНК. Четири cDNA фрагмента, обхващащи пълния геном на вируса CHIKV 181/25, са генерирани чрез обратна транскрипция и PCR с висока точност. Последователностите на cDNA клонингите бяха определени чрез използване на специфични за последователността CHIKV олигонуклеотидни праймери за потвърждаване на cDNA последователности към публикуваната последователност CHIKV 181/25 (TSI-GSD-218; присъединяване на GenBank> L37661). Секвенирането разкрива наличието на генетични варианти в амино-терминалната област на неструктурния полипротеин (nsP). Например, само 1 от 7 секвенирани клона на cDNA, клон 3.5–40, съдържа остатък Ile301 в nsP1, който е идентичен с публикуваната последователност от 181/25 (Фигура (Фигура 1 1 А). Останалите 6 клона съдържат Thr301, характерен за дивия тип CHIKV, както и за изолат VR1 от 181/25 ваксиниран виремичен пациент, който е развил лека артралгия [18, 19]. Хетерогенност е открита и при остатък 314 (Фигура (Фигура1 1 А). Въпреки че нито аминокиселинните остатъци 301 или 314 са отговорни за затихването [18], наличието на генетични варианти в популацията на вируса може да допринесе за фенотипна хетерогенност на ваксината 181/25.

Потвърдени с последователност cDNA фрагменти се комбинират в получения от pcDNA3.1 плазмид, за да генерират p181/25-7 iDNA плазмид, съдържащ cDNA с пълна дължина на клон 181/25 геномна РНК надолу по веригата от основния CMV-непосредствен-ранен промотор (Фигура (Фигура 1). 1). Тъй като автентичните 5′- и 3′-краища на РНК са от решаващо значение за репликацията на алфавирус [2], CMV промоторът и HDV регионите на рибозима са оптимизирани, за да осигурят транскрипция на функционалната 181/25 геномна РНК. Два допълнителни варианта на CHIKV iDNA също бяха подготвени (Фигура (Фигура 1). 1). За да се покаже приложимостта на iDNA подхода за инженериране на нови CHIKV ваксини, p181/25-39 iDNA беше подготвена чрез вмъкване на дублиращ се 26S субгеномен промотор между гените на капсид и гликопротеин 181/25 (Фигура (Фигура 1 1 B). Предишен проучвания показват, че 2 гена могат да бъдат експресирани от алфавирус по тандемен начин [24]. Накрая, p181/25-1 iDNA вариантът е направен чрез заместване на pcDNA3.1 векторния скелет в p181/25-7 с pCRII гръбначен стълб, за да придаде резистентност към канамицин на iDNA плазмида. По този начин, както p181/25-7, така и p181/25-1 кодират последователностите CHIKV 181/25 и се различават само по отношение на векторния гръбначен стълб и антибиотичен ген.

Стартиране на репликация на ваксинирани ваксини на живо от iDNA In vitro

Трансфекция на имунизационен ДНК (iDNA) плазмид p181/25-7 в CHO клетки. A, Имунизационният ДНК (iDNA) подход за стартиране на жив атенюиран вирус на чикунгуня вирус (CHIKV) в еукариотни клетки е показан вляво. Посочени са промоторът на цитомегаловирус (CMV) (отворена стрелка), клетъчното ядро ​​и потомственият вирус. Експресията на CHIKV антигени след трансфекция на iDNA плазмид е показана вдясно, открита чрез имунофлуоресцентен анализ (IFA) 48 и 96 часа след трансфекцията. Аликвоти от трансфектирани клетки се посяват в 8-ямкови камерни стъкла, фиксират се в посочените часове в студен ацетон и се обработват от IFA, като се използва специфично за мишка CHIKV антитяло, последвано от конюгирано флуоресцеин изотиоцианат вторично антитяло. B, Откриване на CHIKV антигени в трансфектирани CHO клетки чрез Western blot (вляво) и в растежната среда чрез анализ на плаката 48 часа след трансфекцията (средата). За сравнение е показан анализ на плака за ваксината срещу вируса 181/25 (пасаж 1 в клетки CHO). Десният панел показва кривата на растеж на p181/25-7 iDNA-получен вирус (средно за 3 експеримента). Уестърн блот беше направен, използвайки човешки CHIKV-специфичен серум с фаза на възстановяване (път 1) и CHIKV HMAF (път 2). Посочени са антигените PE2, E2, E1 и C.

Криви на растежа на вирусите на чикунгуня (CHIKV) в заразените с вируси (пунктирани линии) и в имунизиращата ДНК (iDNA) - трансфектирани (плътни линии) Vero клетки. Клетките бяха заразени с посочени вируси или трансфектирани чрез електропорация с посочени iDNA плазмиди (Фигура (Фигура 1). 1). Обозначенията на вирусите и количествата на iDNA плазмидите са показани вдясно. Присъствието на вируса в растежната среда се определя чрез анализ на плаки в дубликати. Всяка точка от данни представлява средната стойност от 2 измервания. Изчислени са стандартни отклонения, но не са показани, за да се подобри яснотата на графиката. PFU, единица за образуване на плаки.

Имуногенност и ефикасност на CHIKV iDNA ваксина при мишки

маса 1.

Имуногенност на p181/25-7 имунизационна ДНК (iDNA) и родителски ваксини 181/25 при мишки BALB/c

Ваксина CHIKV
Route a Animals, No.Seroconverted/Общо (%) b Титър за неутрализация на вируси, c PRNT80, обхват (среден) PRNT80 (брой мишки) PRNT50,
Обхват (среден) PRNT50 (брой мишки)
p181/25-7 iDNA, интрамускулно88/8 (100)320–1280 (640,00)

b Открива се чрез имунофлуоресцентен анализ и Western blot.

c Тестове за неутрализация на редуциране на плака, показващи 80% (PRNT80) и 50% (PRNT50) намаляване на броя на плаките, съответно, след инкубация със серумни антитела от ваксинирани мишки BALB/c.

Откриване на серумни антитела в серуми от ваксинирани мишки BALB/c, чрез имунофлуоресцентен анализ. A, Мишки 1–8 бяха ваксинирани интрамускулно чрез електропорация in vivo с 10 μg имунизационна ДНК (iDNA) p181/25-7. B, Мишки 9-16 се инжектират подкожно с 10 5 плакообразуващи единици жив вирус 181/25. Серумите са получени на 21-ия ден след ваксинацията и са изследвани при разреждане 1:10, последвано от конюгирано антимиши антитяло с флуоресцеин изотиоцианат. Позитивната реакция на вируса Chikungunya (CHIKV) се обозначава със зелени флуоресцентни огнища. В този експеримент използвахме ядреното противооцветяване на пропидиев йодид за визуализиране на клетъчните ядра [28]. Червената флуоресценция показва ядрено оцветяване.

Съкращения: PBS, буфериран с фосфат физиологичен разтвор; PFU, единици, образуващи плаки.

мишки BALB/c бяха ваксинирани чрез интрамускулно инжектиране-електропорация на 10 μg p181/25-7 iDNA (Фигура (Фигура 1 1).

b Открито чрез имунофлуоресцентен анализ.

c Предизвикателството се извършва интраназално с 6 × 106 PFU на CHIKV-Ross вирус в обем от 20 μL, както е описано другаде [22].

Откриване на серумни антитела в серуми на ваксинирани мишки BALB/c, чрез имунофлуоресцентен анализ (IFA). Мишки 1-10 бяха ваксинирани интрамускулно чрез електропорация in vivo с 10 μg имунизационна ДНК p181/25-7. Серумите бяха взети на 21-ия ден след ваксинацията и изследвани при разреждане 1:10, последвано от конюгирано антимиши антитяло с флуоресцеин изотиоцианат. Позитивната реакция на вируса Chikungunya (CHIKV) се обозначава със зелена флуоресценция. В този експеримент IFA ядреното противооцветяване на пропидиев йодид не се използва. Следователно, зелените флуоресцентни CHIKV-специфични фокуси са показани на тъмен фон. Посочени са също така не откриване на CHIKV антиген чрез серуми от неваксинирани контролни мишки (буфериран с фосфат физиологичен разтвор [PBS]) и откриване на антиген чрез специфичен за вируса антисерум (α-CHIKV).

ДИСКУСИЯ

Бележки

Благодарности. Благодарим на Брайън Николс, Рут Флорес, Елена Клюшненкова и Игор Лукашевич, за експертна помощ и дискусии; Робърт Теш и Патриша Репик, за съдействие за получаване на ваксина 181/25 и реактиви от Световния референтен център за нововъзникващи вируси и арбовируси; и ATCC и BEI ресурси, за осигуряване на HMAF на мишката.

Опровержение. Съдържанието на тази статия е отговорност единствено на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на финансиращите агенции.

Финансова подкрепа. Тази работа беше подкрепена от Националния институт по алергии и инфекциозни болести, Национални здравни институти (награди 1R03AI094159 и 1R01AI093491).

Потенциални конфликти на интереси. Всички автори: Няма съобщени конфликти.

Всички автори са подали формуляра ICMJE за разкриване на потенциален конфликт на интереси. Разкрити са конфликти, които редакторите смятат за релевантни на съдържанието на ръкописа.