Международен вестник
на молекулярни
Лекарство

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Чаня Инпрасит
• Ю-Чуен Хуанг
• Й-Уен Лин

Тази статия се споменава в:

Резюме

Въведение

Преходният рецепторен потенциал ванилоид 1 (TRPV1) е един от 6-те членове на подсемейството на катионния канал. TRPV1 е първата единица в тази последователност, която е посочена и най-остро характеризирана, поради способността си да действа като хомотетрамерен, неселективен, калциев пропусклив катионен канал (10,11). TRPV1 е добре известен с ролята си в ноцицепцията и възпалението, което може да възникне при понижени нива на pH (pH 6,0) и високи температури (43 ° C) (12). Освен вече споменатите фактори, има и други фактори, които са свързани с функцията TRPV1, като патологично наддаване на тегло и някои психосоматични разстройства (13,14). Този отговор предизвиква сигнална каскада в невроните чрез активиране на протеинкинази, включително активирана от митоген протеинкиназа (MAPK) и цикличен AMP-отговор елемент, свързващ протеин (CREB) (15). Тези семейства протеинкинази са вторичните пратеници, които медиират вътреклетъчната сигнализация. Тези кинази включват протеин киназа А (PKA) и протеин киназа C (PKC). Тези сигнални каскади са важни за поддържане на хомеостазата и могат да бъдат стимулирани и/или инхибирани от различни фактори като акупунктура. Редица патологични механизми са свързани с дисрегулацията на един, много или всички фактори, свързани с тези сигнални пътища (16,17).

Материали и методи

Експериментални животни

Acupoint лечение за вграждане на кетгут

Събиране на проби

В процеса на събиране на проби, след като пациентите са гладували в продължение на 12 часа, 38 лица са евтаназирани с 5% изофлуран чрез вдишване. Кръвни проби бяха събрани от орбиталния синус в 3 ml BD Vacutainer стъклени епруветки с 5,4 mg K2 EDTA и 2 ml BD Vacutainer стъклени епруветки с 3 mg натриев флуорид и 6 mg Na 2 EDTA. Пробите се центрофугират при 1500 х g в продължение на 15 минути при 25 ° С, след което отделената плазма се събира в епруветки с микроцентрифуга от 1,5 мл и се съхранява при -80 ° С. След събирането на кръвните проби животните бяха обезглавени и мозъците бяха изрязани за анализ на вестерн-блот. След това мастните тъкани бяха събрани от различни области на тялото; НДНТ от интерскапуларната област, подкожна WAT (sWAT) от двете страни на хълбочната област и висцерална WAT (vWAT) от перигонадната област (26). И накрая, черният дроб и двата бъбрека бяха незабавно разчленени и претеглени.

Western blot анализ

Western blot анализ е аналитична техника, която се използва широко за изследване на протеини. Този метод, описан за първи път от Towbin et al (27), използва антитяло, което разпознава и се свързва с епитоп, уникален за протеина, който представлява интерес. В настоящото проучване, след жертвоприношението, хипоталамусът, префронталната кора (PFC) и NTS незабавно бяха разчленени и замразени в лед преди съхранение при -80 ° C. Общите протеини се приготвят чрез абразия и лизис в разтвор на 50 mM Tris-HCl рН 7,4, 250 mM NaCl, 1% NP-40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 0,02% NaN 3 и 1X протеазен инхибиторен коктейл (Amresco, LLC) преди центрофугиране при 10 000 × g за 10 минути при 4 ° C. Протеини от всяка проба се зареждат в 8% SDS-Tris глицинов гел гел за електрофореза и се прехвърлят върху PVDF мембрани, които след това се блокират с 5% обезмаслено мляко в TBS-T буфер (10 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % Tween-20) и се инкубира в продължение на 1 час при стайна температура със следните първични антитела: Anti-TRPV1 (

95 kDa; Аломон; котка не. ACC-030; 1: 1000), анти-p-PI3K (

110 kDa; Novus Biologicals, LLC; котка не. NBP2-15071; 1: 1000), анти-PI3K (

126 kDa; Abcam; котка не. ab154598; 1: 1000), антифосфорилиран (p) -Akt (

65 kDa, Thermo Fisher Scientific, Inc .; котка не. 44-621G; 1: 1000), анти-Акт (

65 kDa; Merck KGaA; котка не. 16-293; 1: 1000), анти-p-mTOR (

289 kDa; Merck KGaA; котка не. 09-213; 1: 1000), анти-mTOR (

238 kDa; Abcam; котка не. ab2732; 1: 1,000), анти-р-извънклетъчна сигнално-регулирана киназа (ERK) 1/2 (p-ERK)

42 kDa; Abcam; котка не. ab138482; 1: 1000), анти-ERK (

42-44 kDa; Cell Signaling Technology, Inc .; котка не. 4695; 1: 1,000), анти-p-c-Jun N-терминална киназа (p-JNK;

45-55 kDa; Thermo Fisher Scientific, Inc .; котка не. 44-682G; 1: 1000), анти-JNK (

46-54 kDa; Cell Signaling Technology, Inc .; котка не. 9252; 1: 1,000), анти-р-р38 митоген-активирана протеин киназа (р-р38;

41 kDa; Thermo Fisher Scientific, Inc .; котка не. 44-684G; 1: 1000), анти-p38 (

43 kDa; Cell Signaling Technology, Inc .; котка не. 9212; 1: 1000), анти-p-NF-кВ (

65 kDa; Merck KGaA; котка не. ABS403; 1: 1000), анти-NF-кВ (

65 kDa; Cell Signaling Technology, Inc .; котка не. 8242; 1: 1000), анти-p-CREB (

43 kDa; Merck KGaA; котка не. 06-519; 1: 1000), анти-CREB (

43 kDa; Cell Signaling Technology, Inc .; котка не. 9197; 1: 1,000), анти-р-протеин киназа С тип епсилон (p-PKCε;

82 kDa; Санта Круз биотехнологии, Inc .; котка не. SC-12355; 1: 1000), анти-PKCε (

84 kDa; Abcam; котка не. ab63638; 1: 1000), анти-р-протеин киназа AII α (p-PKAIIα;

40 kDa; Санта Круз биотехнологии, Inc .; котка не. SC-12905; 1: 1000) или анти-PKAIIα (

40 kDa; Санта Круз биотехнологии, Inc .; котка не. SC-136262; 1: 1000) в TBST с 1% говежди серумен албумин (BSA) (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Конюгирана с хрян пероксидаза AffiniPure коза анти-мишка (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc .; кат. № 115-035-003; 1: 5000), коза против заек (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc; кат. № 111-035 -003; 1: 5000) и магарешка анти-коза (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc .; кат. № 705-035-003; 1: 5000) вторични антитела бяха инкубирани с мембраните за 1 h инкубация при стайна температура. Протеиновите ленти на мембраните се визуализират с помощта на подобрен комплект хемилуминесцентен субстрат (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) с LAS-3000 Fujifilm (Fuji Photo Film Co. Ltd). Плътността на изображението на специфичните ленти е количествено определена от софтуера ImageJ на Националните здравни институти (NIH) (версия 1.8.0).

Имунофлуоресценция

Общо 4 субекта от групите WT-HFD, WT-HFD-ACE, WT-HFD-SHAM и KO-HFD бяха анестезирани с 1% изофлуран чрез инхалация и инфузионно перфузирани с физиологичен разтвор, последван от 4% параформалдехид. Мозъкът веднага се дисектира и след това се фиксира с 4% параформалдехид при 4 ° С за една нощ. След фиксираните тъкани се поставят за една нощ в 30% захароза за криозащита при 4 ° С. Мозъкът е вграден в OCT и незабавно замразен с помощта на течен азот преди съхранение при -80 ° C. Замразените сегменти бяха нарязани с дебелина от 16 µm ширина върху криостат, след което бяха поставени върху стъкла. Пробите се инкубират с блокиращ разтвор, който се състои от 3% BSA, 0,1% Triton X-100 и 0,02% натриев азид, в продължение на 2 часа при стайна температура. След блокиране, мозъчните проби бяха инкубирани за една нощ с първичното антитяло, TRPV1 (

95 kDa; Аломон; котка не. ACC-030; 1: 200), pPKAIIα (

40 kDa; Санта Круз биотехнологии, Inc .; котка не. SC-12905; 1: 200), p-PI3K (

110 kDa; Novus Biologicals, LLC; котка не. NBP2-15071; 1: 200) и p-CREB (

43 kDa; Merck KGaA; котка не. 06-519; 1: 200), приготвен в разтвор на BSA при 4 ° С за една нощ. Вторичните антитела, конюгирани с Alexa Fluor 488 магарешки анти-заек (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc .; кат. № 711-545-152; 1: 500), магарешка анти-мишка (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc., cat . № 715-545-150; 1: 500) и 594-конюгиран магарешки анти-козел AffiniPure (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc .; кат. № 705-585-003; 1: 500) са използвани за инкубация в стаята температура за 2 часа преди да бъде фиксирана с покривни фишове за визуализация на имунофлуоресценция. Пробите се наблюдават с епифлуоресцентен микроскоп (BX-51; Olympus Corporation) с × 200 общо увеличение (× 20 числова апертура (NA = 0,4) обективна леща и × 10 очна леща). Изображенията са анализирани от софтуера NIH ImageJ (версия 1.8.0).

ELISA

Статистически анализ

Фигура 1

Фигура 2

Фигура 3

Фигура 4

Фигура 5

Фигура 6

Експресионни нива на TRPV1, p-PI3K, p-CREB и p-PKAIIα в хипоталамуса. (A) Представително имунофлуоресцентно оцветяване на TRPV1 (зелено) и p-PKAIIα (червено) и (B) представително имунофлуоресцентно оцветяване на p-PI3K (червено) и p-CREB (зелено) бяха извършени в хипоталамуса на субекти в WT- HFD, WT-HFD-ACE, WT-HFD-SHAM и KO-HFD групи. Белите върхове на стрелки показват имунопозитивни клетки. TRPV1, преходен рецепторен ванилоиден член 1; WT, див тип; ND, нормална диета; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; ACE, вграждане на кетгут acupoint; KO, нокаут; р, фосфорилиран; PKAIIα, протеин киназа AII α; CREB, цикличен AMP-отговор елемент, свързващ протеин.

Фигура 7

Нива на изразяване на TRPV1, p-PI3K, p-CREB и p-PKAIIα в NTS. (A) Представително имунофлуоресцентно оцветяване на TRPV1 (зелено) и p-PKAIIα (червено) и (B) представително имунофлуоресцентно оцветяване на p-PI3K (червено) и p-CREB (зелено) бяха извършени в NTS на субекти в WT- HFD, WT-HFD-ACE, WT-HFD-SHAM и KO-HFD групи. Белите върхове на стрелки показват имунопозитивни клетки. TRPV1, преходен рецепторен ванилоиден член 1; WT, див тип; ND, нормална диета; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; ACE, вграждане на кетгут acupoint; KO, нокаут; р, фосфорилиран; PKAIIα, протеин киназа AII α; CREB, цикличен AMP-отговор елемент, свързващ протеин; NTS, ядро ​​трактус солитарии.

Дискусия

Следователно настоящото проучване заключава, че нивата на TRPV1, p-PI3K, p-mTOR, p-Akt, p-ERK, p-p38, p-JNK, p-PKCε, p-PKAIIα, p-CREB и p-NF -κB участват в развитието на затлъстяване и те могат да бъдат регулирани чрез лечение с АСЕ. В допълнение, заличаването на гена TRPV1 намалява риска от развитие на затлъстяване, независимо от приема на храна, както се вижда от сравнението между режимите на хранене с ND и HFD. И накрая, лечението с АСЕ в двустранната акупунктура ST36 насърчава контрола на теглото чрез намаляване на приема на храна.

Финансиране

Настоящото проучване беше финансово подкрепено от MOST 107-2320-B-039-033.

Наличност на данни и материали

Данните, използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при поискване.

• Dietonus IT - лечение за отслабване Партньорски програми, оферти
• Истински Можете ли да отслабнете с онлайн магазин за контрол на порциите - MUDMAN
• ИЗТЕГЛЕТЕ Е-КНИГА (Диета за круиз контрол 28-дневният план за автоматично тегло
• Зелен чай и кафе Отслабване - Контрол на апетита за намаляване на приема на калории Обелени термогенни мазнини
• Поставете медицински разходи за отслабване и контрол на апетита, за да намалите приема на калории в Keto - Storm Ventures