К.Л. и Д.Р. допринесе еднакво за това проучване.

промени

Резюме

Въведение

Затлъстяването се характеризира с натрупване на мастна маса и често се свързва с дисфункция на мастната тъкан (AT) (1). Клиничните данни показват, че затлъстяването вече се развива през ранното детство между 2 и 6 годишна възраст (2). Разширяването на AT може да се постигне чрез хиперплазия (увеличаване на броя на адипоцитите) или хипертрофия (увеличаване на размера на адипоцитите) или комбинация от двете (3). Ранните проучвания предполагат, че броят на адипоцитите се определя в детска възраст и остава относително постоянен по време на зряла възраст, което предполага, че разширяването на AT маса при (за възрастни) затлъстяване се случва чрез хипертрофия на адипоцитите (4,5). От друга страна, способността за клетъчно обновяване, постигната чрез диференциация на преадипоцити в зрели адипоцити, се запазва през целия живот (6). Дали разширяването на AT при развитието на затлъстяване се случва предимно чрез хиперплазия или хипертрофия и моментът, в който възниква дисфункцията на AT, все още е въпрос на дебат.

В допълнение към самото натрупване на мастна маса, затлъстяването често се свързва с промени в биологията и функцията на AT, включително смърт на адипоцитните клетки, автофагия, хипоксия, променен адипокинов профил, ремоделиране на извънклетъчния матрикс и възпаление (7). Предполага се, че тази AT дисфункция е основен фактор за неблагоприятните метаболитни и сърдечно-съдови последици от затлъстяването, наблюдавани клинично (8). По-специално, инфилтрацията на макрофаги в AT и произтичащият от това оркестриран възпалителен отговор изглежда играят роля в развитието на свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност и сърдечно-съдови заболявания (9,10). Забележителни, свързани със затлъстяването съпътстващи заболявания, включително инсулинова резистентност, хипертония и дислипидемия, вече са очевидни при деца и юноши (2,11).

Досега повечето проучвания, фокусирани върху свързаната със затлъстяването дисфункция на АТ, са провеждани при възрастни. Като се има предвид факта, че затлъстяването и появата на първи свързани коморбидни заболявания се развиват още в детска възраст (2), проучванията при деца могат да позволят по-добър поглед върху ранните процеси, протичащи с нормално развитие и прогресия на затлъстяването на ниво AT. В допълнение, децата обикновено представляват по-ранни стадии на заболяването и изучаването на основните механизми е по-малко пристрастно от съществуващите съпътстващи заболявания и тяхното лечение.

Целта на тази работа е да се оценят свързаните със затлъстяването промени в биологията на АТ при деца и да се оцени тяхната връзка с клиничните параметри. По-специално, искахме да проверим хипотезата, че натрупването на AT при затлъстяване при деца е свързано предимно с хипертрофия на адипоцитите и води до възпаление на AT и дали тези промени са свързани с ранната поява на клинични съпътстващи заболявания при деца.

Изследователски дизайн и методи

Субекти и проби (Лайпцигска детска възраст в кохорта)

Подкожни AT проби са получени от 171 кавказки деца (0-18 години), подложени на планова ортопедична хирургия (n = 98), херниотомия/орхидопексия (n = 54) или други операции (n = 19). Получените тъканни проби тежат от 0,04 до 16,4 g. Децата са лишени от тежки заболявания и лекарства, които потенциално влияят върху биологията на AT. Бяха приложени следните критерии за изключване: диабет, генерализирано възпаление, злокачествено заболяване, генетични синдроми или трайно обездвижени деца. Писмено информирано съгласие е получено от всички родители. Изследването е одобрено от местната комисия по етика (265–08, 265–08-ff) и е регистрирано в базата данни на Националните клинични изпитвания (NCT02208141).

Данните за ИТМ са стандартизирани за специфични за възрастта и пола немски референтни данни и са дадени като BMI SD резултат (SDS). Границата от 1,28 и 1,88 SDS определя наднорменото тегло и затлъстяването при деца (12). Кожните гънки се измерват с дебеломер Harpenden (Holtain Ltd., Crosswell, Crymych, UK). Оценките за процента телесни мазнини и общата телесна AT маса са изчислени от трицепс и субскапуларна кожна гънка според Slaughter et al. (13).

Взети са кръвни проби на гладно преди операцията. Нивата на адипонектин, лептин, hs-CRP, фактор на туморна некроза-α (TNF-α), интерлевкин-6 (IL-6), глюкоза и инсулин бяха измерени от сертифицирана лаборатория. HOMA на инсулиновата резистентност (HOMA-IR) беше изчислена за оценка на инсулиновата резистентност (14). Неправдоподобните стойности бяха изключени от анализа (лептин ≤0,2 ng/ml).

Изолиране на адипоцити и клетки на стромалната съдова фракция от човешки AT проби

След изрязване по време на операцията, подкожните AT проби се промиват три пъти в PBS. Приблизително 100 mg AT веднага се замразяват в течен азот за изолиране на РНК и 50 mg се фиксират в 4% параформалдехид за хистологични анализи. Останалата част от пробата се претегля и смила, а адипоцитите и клетките на стромалната съдова фракция (SVF) се разделят чрез разграждане на колагеназа (1 mg/ml). SVF клетките бяха бързо замразени в течен азот за изолиране на РНК или бяха подложени на анализи за пролиферация и диференциация. Адипоцитите бяха директно подложени на експерименти с липолиза или фиксирани в осмиев тетроксид за анализ на разпределението на размера на клетките и броя им с помощта на брояч на Coulter (Multisizer III; Beckmann Coulter, Krefeld, Германия) с отвор 560 µm (15,16). Ефективният обхват на анализираните размери на клетките е 50–250 μm. За всеки участник пиковият диаметър на адипоцитите (диаметър, при който честотата на адипоцитите достига максимум) е извлечен от графика на Multisizer според McLaughlin et al. (17). Решихме да използваме този подход след методологично сравнение с ръчния метод (допълнителни данни). Общият брой на адипоцитите се изчислява чрез разделяне на броя на адипоцитите на грамова проба на общата AT маса на тялото.

Капацитет за разпространение и диференциация

SVF клетките бяха посяти без предшестващо пасиране при 10 000 клетки/cm 2 за пролиферация или 33 000 клетки/cm 2 за анализи на диференциация в 96- или 48-ямкови плаки, съответно, и инкубирани в хранителна среда (DMEM/F-12, 10% FBS, 100 единици пеницилин, 0,1 mg/ml стрептомицин) при 37 ° C и 5% CO2. Клетъчната пролиферация се оценява чрез преброяване на оцветени в Hoechst 33342 (Sigma) ядра на 2, 4, 6, 8 и 10 ден след засяване чрез флуоресцентна микроскопия. Диференциацията на адипоцитите е извършена съгласно протокола от стволови клетки на Poietics от човешки мастни клетки - адипогенеза (Lonza, Кьолн, Германия). Ефективността на диференциация е дадена като процент нил червени/Hoechst двойно оцветени клетки от общия брой Hoechst-положителни клетки и като Oil Red O абсорбция при 540 nm (FLUOstar OPTIMA; BMG LABTECH, Офенбург, Германия) за ямка на ден 8. Адипонектин в супернатантите на диференцирани клетки се определя чрез ELISA (Mediagnost, Reutlingen, Германия).

Липолитичен капацитет на изолирани адипоцити

Прясно изолирани адипоцити (50 µL) се разреждат в 250 µL среда без серум (DMEM/F-12, 0,8% BSA) със или без 10 µmol/L изопротеренол в продължение на 20 h (18,19). Количеството глицерол, освободено в средата, се определя с помощта на свободен глицеринов реагент (Sigma). Липолитичната активност се нормализира до броя на адипоцитите, определен по метода на Coulter counter и се дава като освобождаване на глицерол в ng/ml на 1000 адипоцити.

Имунохистохимични анализи

Пробите от тъкани бяха фиксирани в 4% параформалдехид, вградени в парафин и разделени (12 µm). Имунохистохимичните оцветявания бяха извършени с моноклонално CD68 антитяло (1: 500; M0718, DAKO), използвайки системата DAKO REAL APAAP Immunocomplex съгласно протокола на производителя.

РНК изолация и анализи на експресия на иРНК

Изолирането на РНК и количествената PCR в реално време от цели AT проби или изолирани SVF клетки се извършват, както е описано по-рано (15). Последователностите на грунда и сондата са изброени в допълнителната таблица 1.

Статистически анализи

Данните, които не се придържат към Гаусовото разпределение, са били трансформирани преди анализи. Параметрични тестове (корелационен анализ на Пиърсън, студентски t тест, еднопосочен ANOVA с Dunnett post hoc тест) бяха приложени за количествени признаци и χ 2 тест за категориални променливи. В случай на TNF-α и IL-6 иРНК и IL-6 серумни нива, log-трансформацията не доведе до Гаусово разпределение и бяха приложени непараметрични тестове (корелационен анализ на Spearman, U-тест на Mann-Whitney). В групата се комбинира стратификация за затлъстяване, пациенти с наднормено тегло и затлъстяване. За многократни регресионни анализи беше използван поетапният модел напред. Статистическият анализ беше извършен с помощта на Statistica 7.1 (StatSoft, Tulsa, OK).

Резултати

Общите характеристики на пациентите и пробите от нашата кохорта от детството в Лайпциг са обобщени в Таблица 1. Участниците в изследването в постните и затлъстелите подгрупи не се различават по отношение на разпределението на пола и пубертета, въпреки че затлъстелите деца са по-възрастни от слабите деца (Таблица 1).

Характеристики на детството в Лайпциг AT кохорта (n = 171)

Размерът и броят на адипоцитите са свързани с натрупването на AT при деца

Обърнахме се към спорно дискутирания въпрос дали натрупването на мазнини е резултат от хипертрофия и/или хиперплазия чрез оценка на потенциалните връзки на размера на адипоцитите и общия брой на адипоцитите с натрупването на AT (5,20,21). В сравнение с постните контроли, размерът на адипоцитите и общият брой на адипоцитите са значително увеличени при деца със затлъстяване съответно със 17,2 и 164% (Таблица 1) и са свързани с параметри, свързани със затлъстяването, като BMI SDS (фиг. 1А и В) и AT маса (Фиг. 1C и D). Както размерът на адипоцитите, така и общият брой на адипоцитите се увеличават с възрастта в постната подгрупа (фиг. 1E и F). Размерът на адипоцитите, но не и броят на адипоцитите, също корелира с възрастта в подгрупата със затлъстяване (Фиг. 1E и F).

Асоциация на размера и броя на адипоцитните клетки с възрастта и мастната маса. Средният диаметър на адипоцитите и общият брой на адипоцитите се увеличават с BMI SDS (A и B) и AT маса (C и D). Диаметърът на адипоцитите е положително свързан с възрастта при слаби и затлъстели деца (Е), докато само слабите деца показват положителна връзка между общия брой на адипоцитите и възрастта (F). Както размерът на адипоцитните клетки (G), така и броят на адипоцитите (H) се увеличават при затлъстелите в сравнение с слабите деца във всички възрастови групи от детството (6–8 години) до ранната зряла възраст (16–19 години). Коефициентът на корелация на Пиърсън R и P стойността са дадени във всеки разпръснат график. Значителни стойности на P (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Множествени регресионни анализи за антропометрични параметри в цялата Лейпцигска детска възраст в кохортата

Разпространението, но не и диференциацията на SVF клетките се засилва при затлъстели деца

Наблюдаваното увеличение на броя на адипоцитите може да е резултат от засилена пролиферация на адипогенни клетки-предшественици и последваща диференциация в зрели адипоцити. Поради това анализирахме потенциал на пролиферация и диференциация на прилепнали клетки на SVF, изолирани от AT проби in vitro. Добивът на получените SVF клетки е сравним между слаби и затлъстели деца (9,7 ± 1,0 срещу 9,9 ± 1,4 × 10 4 SVF клетки на g AT; P = 0,680), както и процентът на прилепналите SVF клетки (23,6 ± 6,6 срещу 21,2 ± 5,6%; P = 0,570).

Наклонът на увеличаване на броя на клетките в клетъчната култура изглежда е по-стръмен при затлъстелите в сравнение с слабите деца, което води до пет пъти по-висок брой клетки на 10-ия ден след засяването при затлъстели деца (Фиг. 2А). В съответствие с това, времето за удвояване на SVF клетки се ускорява при деца със затлъстяване (Таблица 1) и корелира отрицателно с ИТМ SDS (Фиг. 2В). Няма връзка на времето за удвояване на SVF клетки с възрастта в цялата кохорта (фиг. 2С) или само при слаби деца (R = 0,157; ​​P = 0,547). Освен това времето за удвояване на SVF клетки не е свързано с размера на адипоцитите (Фиг. 2D и Таблица 3).

Анализи на функционални параметри след разслояване в тертили с диаметър на адипоцитите

Процентът на диференцирани SVF клетки не е различен при затлъстели в сравнение с слаби деца (Таблица 1 и Фиг. 2Е) или в проби от малки адипоцити в сравнение с големи адипоцити (Таблица 3), както е документирано от подобни нива на абсорбция на Oil Red O (Фиг. 2F) и концентрация на адипонектин в супернатантите на диференцираните клетки (фиг. 2G). Представителни изображения на диференцирани клетки от слаби и затлъстели деца са показани на фиг. 2Н и допълнителна фиг. 2.

Подобрена инфилтрация на макрофаги при AT на затлъстели деца

За да оценим възпалението при AT на деца, ние изследвахме инфилтрацията на макрофаги в AT и връзката с размера на адипоцитите. Броят на CD68 + макрофагите се удвоява при деца със затлъстяване в сравнение с слаби деца (Таблица 1) и има слаба, но значителна положителна корелация с ИТМ SDS (Фиг. 3А) и възрастта (Фиг. 3В). Когато ограничихме корелационните анализи само за слаби деца, връзката между броя на макрофагите и възрастта беше загубена (R = 0,177; P = 0,100). Подобни резултати бяха получени за CD68 експресия (Таблица 1). Тъй като се предполага, че хипертрофията на адипоцитите води до инфилтрация на макрофаги (10,20), ние анализирахме връзката между размера на адипоцитите и броя на CD68 + макрофагите и потвърдихме положителна връзка (фиг. 3С). Когато стратифицирахме AT проби в тертили според размера на адипоцитите, наблюдавахме трикратно увеличение на броя на макрофагите в проби, съдържащи големи адипоцити в сравнение с проби, съдържащи малки адипоцити (Таблица 3).

Инфилтрацията на макрофаги е свързана със затлъстяване и диаметър на адипоцитите. Броят на AT макрофагите положително корелира с BMI SDS (A), възрастта (B) и размера на клетките на адипоцитите (C). Коефициентът на корелация на Pearson R и P стойността са показани във всеки разпръснат график. Значителни стойности на Р (Р + макрофаги, заобикалящи адипоцит) (Фиг. 3D), които открихме при почти половината от затлъстелите деца, но при по-малко от 10% от слабите деца (Таблица 1). В допълнение, наличието на CLS се увеличава с размера на адипоцитите (Таблица 3).

След това анализирахме връзката на инфилтрацията на макрофаги в AT към възпалителни маркери като hs-CRP, TNF-α или IL-6. Наблюдавахме значително повишени серумни нива на hs-CRP при затлъстели в сравнение с слаби деца (Таблица 1). Децата със затлъстяване обаче не показват повишени серумни нива на TNF-α или IL-6, нито експресия на TNF-α или IL-6 в AT (Таблица 1). При корелационни анализи броят на макрофагите не е ясно свързан с hs-CRP (R = 0,165; P = 0,085), TNF-α (R = -0,097; P = 0,312) или IL-6 (R = -0,001; P = 0.990) серумни нива или експресия на TNF-α (R = 0.015; P = 0.860) и IL-6 (R = -0.067; P = 0.440). Само hs-CRP серумните нива показват значително увеличение с увеличаване на размера на адипоцитите (Таблица 3).

Базалната липолиза е намалена в адипоцитите на затлъстелите деца

След това характеризирахме метаболитната функция на адипоцитите чрез оценка на липолитичната активност на изолирани адипоцити. Наблюдавахме значително намаляване на основната липолитична активност при затлъстели в сравнение с слаби деца (Таблица 1 и Фигура 4А). Стимулирането с β-агониста изопротеренол доведе до значително увеличаване на липолитичната активност в адипоцитите както на слаби, така и на затлъстели деца (фиг. 4А). Въпреки това, няма значителна разлика в величината на изопротеренол-стимулираната липолитична активност между двете групи (Таблица 1). Базалната липолитична активност (фиг. 4В), но не и стимулираната с изопротеренол липолиза (R = -0,184; P = 0,424) е отрицателно свързана с ИТМ SDS. Нещо повече, базалната липолиза корелира отрицателно с размера на адипоцитите (Фиг. 4С и Таблица 3), който обаче е загубен след корекция за ИТМ SDS (R = −0.11; P = 0.643). Нито базалната, нито стимулираната липолитична активност се променя с възрастта в цялата кохорта (фиг. 4D) или в слабата подгрупа (R = −0.059; P = 0.863).