Затлъстяване

Редактиран от
Туомас Килпелайнен

Фондация Novo Nordisk Foundation for Basic Metabolic Research, University of Copenhagen, Дания

Прегледан от
Мелкам А. Кебеде

Университетът в Сидни, Австралия

Бруно Рамос-Молина

Институт за биомедицински изследвания в Мурсия (IMIB), Испания

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

микрорнк

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Ендокринологичен изследователски център, Москва, Русия
  • 2 Федерален изследователски и клиничен център, Федерална медико-биологична агенция на Русия, Москва, Русия
  • 3 Институт за пулмологични изследвания, Федерална медико-биологична агенция на Русия, Москва, Русия
  • 4 Национален медицински център за кардиология, Москва, Русия
  • 5 Институт по молекулярна биология Енгелхард, Руска академия на науките, Москва, Русия
  • 6 Централна клинична болница и поликлиника, Москва, Русия
  • 7 Институт по пластична хирургия и козметология, Москва, Русия
  • 8 Център по ендохирургия и литотрипсия, Москва, Русия

До 60% от генната експресия може да се регулира от микроРНК (miRs) (9). MiRs са ендогенни, къси, некодиращи молекули с дължина 20-25 нуклеотиди, които могат да свържат комплементарната последователност на иРНК и да инхибират транслацията. Нарастващият брой публикации предполага, че miRs играят ключова роля в мастната тъкан, като насочват метаболизма на адипоцитите и инсулиновата сигнализация (9). Йордан и др. показа, че miR-143 е бил положителен регулатор на диференциацията на човешките адипоцити, действайки чрез ERK5 сигнализиране (10). Други проучвания разкриват, че miR-27a и miR-130a инхибират диференциацията на адипоцитите чрез понижаване на регулацията на PPARγ (11, 12). Thomou et al. наскоро описаха мастната тъкан като основен източник на циркулиращи екзозомни miRs (13). Циркулиращите екзозомни miRs, получени от мазнини, могат да действат като регулатори на метаболизма на цялото тяло и транслацията на иРНК в други тъкани (14-16). Определянето на miR профила на мастната тъкан при пациентите ще помогне не само за диагностични цели, но и за терапевтична стратегия. Тази стратегия може да включва инхибиране на определени miRs, както и увеличаване на нивото на miRs с имитатори на miR (9, 17).

Целта на настоящото проучване беше да се идентифицират разликите в експресията на miR и mRNA между пациенти с T2D + и T2D– със затлъстяване. Започнахме от RNAseq анализ на miRs; След това анализирахме само тези иРНК, които се появиха цели за значителни miRs от първата стъпка.

Предмети и методи

Пациенти

Изследването е одобрено от етичната комисия на Центъра за ендокринологични изследвания (протокол № 9, 10.09.2017 г.). Писмено информирано съгласие беше получено от всички доброволци.

Участваха седемдесет пациенти (35 в група с T2D - и 35 в група с T2D +). Всички пациенти са имали продължително (> 15 години) болестно затлъстяване (ИТМ> 35 kg/m 2). Субекти I n s u l i n r e s i s t a n c e = FI × G/22. 5,

където FI = инсулин на гладно μIU/ml. И G = глюкоза на гладно (mmol/l).

Анализ на RNAseq

Пробите от тъкани от пациенти веднага се поставят в лизисен буфер (50–80 mg в 1 ml QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Германия) и се хомогенизират с TissueLyser LT (Qiagen, Германия). Пълна изолация на РНК от мастна тъкан се извършва от Rneasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Германия) на автоматичната станция QIAcube съгласно протокола на производителя. За да се предотврати разграждането, добавихме 1 единица инхибитор на Rnase RiboLock (Thermo Fisher Scientific, САЩ) на 1 μL РНК разтвор. Концентрацията на общата РНК във водния разтвор беше оценена на спектрофотометър NanoVue Plus (GE Healthcare, САЩ).

След това експресията на MiRs беше анализирана чрез секвениране на Illumina NextSeq 500 (Illumina, САЩ). Библиотеките бяха подготвени от Illumina TruSeq Small RNA Library Prep Kit следвайки стандартните протоколи на производителя. Секвенирането, специфично за нишките, беше извършено за общо 72 проби (31 проби от T2D - пациенти със затлъстяване и 31 проби от T2D + пациенти със затлъстяване). Обработката на биоинформатиката беше следната: адаптерите бяха подрязани с Cutadapt; след това получените FASTQ файлове бяха картографирани върху човешкия геном (GRCh37 събрание) с bowtie2. FastQC беше използван като инструмент за визуализиране на различни измервания за контрол на качеството.

За всяка проба последователностите бяха анотирани, използвайки човешки pre-miRNA и зрели miRNA бази данни, предоставени от miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/) в SeqBuster. Получените данни за броя са анализирани в DESeq2 за получаване на диференциално експресирани miRNAs. Само log2-кратни промени с коригирани стр-стойности от 0,10 се считат за значими. Използвахме TargetScan, Diana-TarBase v8 и mirPath v.3 за базирано на последователност прогнозиране на целите.

Последователността на mRNAs, специфична за нишките, е извършена от Illumina NextSeq 500. Библиотеките са подготвени от Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit, следвайки стандартните протоколи на производителя. Секвенирането е направено за общо 48 проби (24 проби от T2D - пациенти със затлъстяване и 24 проби от T2D + пациенти със затлъстяване). Обработката на биоинформатиката беше следната: адаптерите бяха подрязани с Cutadapt; получените FASTQ файлове след това се картографират върху човешкия геном (GRCh37 монтаж) с помощта на STAR. HTSeq се използва за преброяване на броя четения и получените данни за броя се анализират в edgeR, за да се получат диференциално изразени иРНК.

Платформата miRNet беше използвана за интегриране на miRs и техните целеви гени.

Pheatmap (R пакет) е използван за диаграмата на топлинната карта; само log2-кратни промени с коригиран стр-стойности от 0,10 се считат за значими.

RT-PCR анализ на данните

Обратна транскрипционно-количествена PCR (RT-qPCR) на miRs в 70 проби се извършва от TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) и TaqMan Advanced miRNA Assays (Thermo Fisher Scientific, USA), в 96 ямки плочи на PCR системата StepOnePlus (Applied Biosystems, САЩ), съгласно протоколите на производителя. Всички проби бяха нормализирани до нива hsa-miR-191 и контролен скок cel-miR-39-3p. Проведени са RT-qPCR анализи за валидиране на резултатите от диференциалната експресия на DESeq2 за miRNAs със средно нормализиран брой> 100.

Проведена е двустепенна qRT-PCR на иРНК в 70 проби, използвайки комплект с голям капацитет RNA-to-cDNA (Thermo Fisher Scientific, САЩ) и персонализирани плочи TaqMan Array 48 Plus (Thermo Fisher Scientific, САЩ), в 96 -пластови плочи на системата PCR StepOnePlus (Applied Biosystems, САЩ), съгласно протокола на производителя. Всички проби бяха нормализирани до GUSB и нивата на GAPDH, HPRT служи като вторичен вътрешен контрол.

Анализът на данните е извършен със софтуер SDS (версия 2.3. Приложни биосистеми). A P стойност 10).

Резултатите от RNAseq данни ни позволиха да разделим нагоре и надолу регулирани гени при пациенти със затлъстяване с T2D + и T2D–. Но при тези групи не са открити специфични модели: и двете групи пациенти са имали регулирани гени, свързани с възпалителни процеси и клетъчна пролиферация (Фигура S1).

RNA-seq генерира средно 47 милиона четения от един край на проба, общо 552 mRNA гени изглежда са DE с праг на значимост, коригиран стр-стойност ≤ 0,05 и сгъване ≥ 2,0. За последващ анализ на RNAseq избрахме гени, които имаха пресечни точки с предварително разкрити значими miRs. Валидирането чрез qPCR анализ потвърди само шест гена, чиято експресия показва значителна разлика: MMP9, MMP2, MMP26, MMP11, SMAD4, RUNX2 (Таблица 3, Таблица S3). Всички тези гени бяха регулирани с повишено ниво при пациенти със затлъстяване с T2D. Изглежда, че повечето гени са членове на семейството цинк-металопротеинази, участващи в разграждането на извънклетъчния матрикс: MMP9, MMP2, MMP26, MMP11. Останалата част от гените принадлежат към сигналния път на TGFβ/BMP: SMAD4 и RUNX2.

Таблица 3. Диференциална експресия на значими валидирани иРНК (сравнение на затлъстели T2D– спрямо затлъстели T2D + групи, коригирано стр-стойност 10).

Таблица S3. ИРНК на диференциална експресия (сравнение MHO срещу MAO, коригирано стр-стойност Ключови думи: метаболитно здравословно затлъстяване, микроРНК, RNAseq, металопротеинази, SMAD4, RUNX2, диабет тип 2

Цитиране: Brovkina O, Nikitin A, Khodyrev D, Shestakova E, Sklyanik I, Panevina A, Stafeev I, Menshikov M, Kobelyatskaya A, Yurasov A, Fedenko V, Yashkov Y and Shestakova M (2019) Роля на микроРНК в регулирането на Подкожна бяла мастна тъкан при лица със затлъстяване и без диабет тип 2. Отпред. Ендокринол. 10: 840. doi: 10.3389/fendo.2019.00840

Получено: 10 септември 2019 г .; Приет: 19 ноември 2019 г .;
Публикувано: 05 декември 2019 г.

Туомас Килпелайнен, Университет на Копенхаген, Дания

Бруно Рамос-Молина, Университет в Малага, Испания
Мелкам Аламерю Кебеде, Университет в Сидни, Австралия