Qingling Yang

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Фейфей Жао

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Линли Ху

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Руй Бай

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Нан Джанг

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Guidong Yao

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Yingpu Sun

1 Репродуктивен медицински център, Първа свързана болница на Университета в Джънджоу, Китай

Свързани данни

Резюме

Дължините на теломерите на левкоцитите (LTL) са по-кратки при затлъстели в сравнение с хората с нормално тегло. Не е известно обаче дали дължината на теломерите на сперматозоидите (STL) е свързана със затлъстяването. Целта на проучването е да се оцени въздействието на индекса на телесна маса (BMI) на мъжете върху STL, качеството на ембрионите и клиничните резултати при двойки, подложени на IVF. Общо бяха наети 651 двойки, включително 345 мъже с нормален ИТМ и 306 мъже с ИТМ с наднормено тегло (нормална ИТМ група: 20–25 kg/m 2; група с ИТМ с наднормено тегло:> 28 kg/m 2). Установихме, че двойките с ИТМ на мъжкия пол над 28 kg/m 2 показват значително по-ниска степен на оплождане, добро качество на ембрионите и клинична честота на бременност в сравнение с нормалните им BMI аналози. Средният STL в групата с ИТМ с наднормено тегло също е значително по-кратък от този на нормалната ИТМ група. Резултатите също така показват, че индивидите с по-висок ИТМ имат по-високо съдържание на ROS (реактивни кислородни видове) и степен на фрагментация на ДНК на сперматозоидите в сравнение с нормални индивиди с ИТМ. Активността на митохондриите също е била по-ниска в групата с ИТМ с наднормено тегло, отколкото в групата с нормален ИТМ. Това е първият доклад, който установява, че STL е по-нисък при мъже с наднормено тегло/затлъстяване, което може да обясни по-лошите им резултати от лечението при IVF цикли.

Теломерите са силно повтарящи се хексамерни (TTAGGG) нуклеотидни последователности в краищата на хромозоми 14. Заедно със свързани протеини, теломерите предпазват хромозомните краища от разпознаване като двуверижни скъсвания, изискващи ремонт. Едно проучване установи, че съкращаването на дълги теломери в сперматозоидите може да помогне за поддържане на критичната дължина на теломерите, необходима за нормалното ембрионално разцепване след оплождането 15. Друго проучване показа, че ооцитите от див тип, оплодени от сперматозоиди с къси теломери от по-късни поколения теломеразни нулеви мишки (TR -/-), водят до повишена фрагментация на ембрионите, ниско качество на ембрионите и апоптоза 16. Нашето най-скорошно проучване също демонстрира, че дължината на теломерите на сперматозоидите (STL) е положително свързана с качеството на ембриона при IVF 17 .

Резултати

Основни характеристики на пациента и резултати от IVF цикъл

затлъстяване

(а) Сравнение на степента на оплождане между двойки с мъже с нормални ИТМ (20–25 kg/m 2; N = 345) и ИТМ с наднормено тегло (> 28 kg/m 2; N = 306) (тест с хи-квадрат). (б) Сравнение на висококачествената ембрионална честота на ден 3 между двойки с мъже с нормални ИТМ (N = 345) и тези с мъже с ИТМ с наднормено тегло (N = 306, тест с хи-квадрат). (° С) Сравнение на клиничната честота на бременност между двойки с мъже с нормален ИТМ (N = 345) и тези с мъже с ИТМ с наднормено тегло (N = 306, хи-квадрат тест).

маса 1

Параметър ИТМ за мъже (kg/m 2)20–25 (N = 345)> 28 (N = 306) P
Мъжка възраст (години)30,4 ± 4,030,5 ± 3,90.91
Възраст на жените (години)29,7 ± 4,929,9 ± 3,90,48
ИТМ на жените (kg/m 2)22,4 ± 3,122,3 ± 3,60,26
Женски базален FSH (IU/L)7,4 ± 2,16,9 ± 2,50,51
Продължителност на Gn (дни)11,2 ± 1,911,0 ± 1,90,13
Gn дозировка (IU)2,034,8 ± 822,62,028,5 ± 817,70,92
Извлечени яйцеклетки (n)11,3 ± 5,911,2 ± 6,50,63
Прехвърлени ембриони (n)2,0 ± 0,31,9 ± 0,50,32

ИТМ, индекс на телесна маса; FSH, фоликулостимулиращ хормон; стойностите са показани като средна стойност ± стандартно отклонение; Тестът на Student's t беше използван за сравняване на данните между двете групи.

Таблица 2

Параметър ИТМ за мъже (kg/m 2)20–25 (N = 345)> 28 (N = 306) P
Концентрация на сперматозоиди (милиони/мл)59,9 ± 54,659,5 ± 51,80,83
Обем на спермата (ml)3,08 ± 1,693,79 ± 1,71 28 kg/m 2 (N = 306)
Ненастроена0,75 (0,64–0,88)
Р 16, 17, 25. Тъй като мъжете със затлъстяване обикновено имат по-къси LTL (дължини на теломерите на левкоцитите), ние изследвахме относителния STL за всеки пациент. Когато сравнихме STLs между двете групи, установихме, че средният относителен STL е значително по-кратък в групата с ИТМ с наднормено тегло, отколкото нормалната група на BMI (Фиг. 2). Предишни проучвания също са установили, че STL е положително свързан с възрастта.

Сравнение на относителния STL (съотношение T/S) при мъже с нормални ИТМ (20–25 kg/m 2; N = 345) и ИТМ с наднормено тегло (> 28 kg/m 2; N = 306) (t тест на Student; лентите представляват стандартни отклонения).

Повишен оксидативен стрес, намалена целостта на ДНК и митохондриална активност в спермата на пациенти с наднормено тегло/затлъстяване

За да оценим нивата на оксидативен стрес в спермата, събрана от групата с ИТМ с наднормено тегло, използвахме метода NBT за откриване на съдържанието на ROS. Събрахме сперма от други 104 пациенти, включително 54 пациенти с ИТМ> 28 kg/m 2 и 50 пациенти с нормален ИТМ. Производството на формазан в серума на мъже с ИТМ с наднормено тегло е значително по-високо от това на тези с нормални ИТМ (допълнителна фигура 1а; Р 26. Въпреки това, участващите механизми са слабо разбрани. През последните две десетилетия АРТ стана по-популярно и е помогнал на много безплодни двойки да имат свои деца. Предишни проучвания показват, че женското затлъстяване оказва пагубно влияние върху плодовитостта и резултатите от лечението при IVF; сравнително малко проучвания са фокусирани върху въздействието на мъжкото наднормено тегло/затлъстяване по време на IVF.

Все повече изследвания се фокусират върху изследването на ролята на дължината на теломерите и на теломеразната система в репродукцията. При теломеразни нулеви мишки, оплождането на ооцити от див тип със сперматозоиди с къси теломери от късни поколения води до повишена фрагментация на ембрионите, ниско качество на ембрионите и апоптоза 16. Едно проучване при хора показа, че дължината на теломерите в кумулусните клетки може да предскаже високо компетентни и висококачествени яйцеклетки 39. Друго проучване демонстрира, че теломеразата е по-добър предиктор за резултатите от бременността след IVF, отколкото дължината на теломерите 40, а нашето скорошно проучване също установи, че STL е положително свързан с ранното ембрионално развитие в IVF цикли 17. В допълнение, няколко проучвания съобщават за ефектите от наднорменото тегло/затлъстяването върху LTL 20, 21, 22, 23. Измерихме STL на всеки пациент; по този начин, това проучване е първото, което оценява как наднорменото тегло/затлъстяването влияе върху относителната дължина на теломерите при човешките сперматозоиди. Интересното е, че открихме, че средният STL е значително по-кратък при мъже с по-висок ИТМ в сравнение с контролите.

В обобщение установихме, че STL е тясно свързан с BMI и че по-високите BMI са свързани с по-къси STL, намалена митохондриална активност и повишена фрагментация на ДНК, което може да е резултат от увеличено съдържание на ROS. Всички тези промени могат да доведат до по-ниски нива на оплождане, качество на ембрионите и клинична честота на бременност при пациенти, подложени на IVF. Взети заедно, тези открития ни помагат частично да разберем ефектите от наднорменото тегло/затлъстяването на бащата върху резултатите от IVF лечението. Предполагаме, че затлъстяването увеличава възпалението и оксидативния стрес, което може да доведе до съкращаване на дължината на теломерите на сперматозоидите, което в крайна сметка води до лошо качество на ранните ембриони и намален процент на бременност. Необходими са обаче допълнителни проучвания, за да се определят подробните причинно-следствени механизми.

Експериментални методи

Избор на пациент

Нашата извадка се състоеше от 306 мъже с наднормено тегло (> 28 kg/m 2) и 345 мъже с нормално тегло (20–25 kg/m 2), отговарящи на възрастта. Всички пациенти са били на лечение в нашия репродуктивен медицински център за първите свежи IVF цикли. Всички пациенти са имали нормални хромозомни кариотипи. Нито един от мъжете не е имал микро делеции на Y хромозома или някакви очевидни причини за сперматогенно увреждане. Нивата на FSH при всички жени са под 10 IU/L. Жените бяха изключени, когато имаха увредена функция на яйчниците, която присъстваше преди проучването, като операция или употреба на вредни лекарства. След оценка на STL при тези пациенти, ние събрахме сперма от други 104 пациенти, включително 54 пациенти с ИТМ> 28 kg/m 2 и 50 пациенти с нормален ИТМ на възраст, за да оценим въздействието на BMI върху оксидативен стрес, митохондриална активност и Скорост на фрагментация на ДНК в спермата. Това проучване беше одобрено от Етичния комитет на Първата свързана болница на Университета в Джънджоу и бе получено информирано съгласие за използването на данни и сперма от всички участници. И накрая, всички методи, използвани в това проучване, бяха проведени в съответствие с одобрените насоки.

IVF процедура

Анализът на спермата е извършен съгласно протокола на СЗО (2010) в деня на извличане на яйцеклетките (Ден 0). Осеменяването се извършва чрез поставяне на кумулусно-ооцитни комплекси (COC) заедно със сперматозоиди, избрани чрез центрофугиране с градиент на плътността. Кумулусните клетки се отстраняват след 4 часа. Оплождането е потвърдено след 16–18 часа на осеменяване. Всеки ембрион от Ден 3 беше оценен и му беше дадена оценка от 1 до 5. Висококачествените ембриони включваха ембриони от степен I и степен II, които бяха определени като имащи шест до осем симетрични бластомери с еднакъв размер, без фрагментация (степен I) или по-малко от 10 % фрагментация (степен II).

Измерване на дължина на теломер

Средният STL се определя в геномна ДНК, като се използва PCR в реално време за всеки пациент. PCR реакциите се провеждат с помощта на 7500 PCR система в реално време (Applied Biosystems, САЩ). Теломерните праймери, контролните генни праймери (36B4, ген с едно копие) и PCR настройките са същите, както е описано преди 17. Всяка проба се провежда в три екземпляра и се създава стандартна крива чрез серийни разреждания на известни количества референтна ДНК за всяка реакция. За изчисляване на относителната дължина на теломерите се използва съотношението на копиране на теломера към единично (T/S). Лабораторен персонал, който е бил сляп за състоянието на контрола на случая и оценката на резултата, е извършил всички измервания.

Анализ на производството на ROS

Стандартизиран протокол беше използван за извършване на фотометричен анализ на нитросин тетразолий (NBT) за измерване на производството на семенни ROS чрез производство на формазан 53. След измиване на спермата във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) при 300 g в продължение на 5 минути, спермата се суспендира отново в 200 μl PBS. След това се добавят 100 μl 0,1% NBT (Sigma-Aldrich, САЩ) и се инкубират при 37 ° С в продължение на 45 минути. След това сперматозоидите се промиват два пъти в PBS при 500 g за 5 минути. Точно 60 μl DMSO (Sigma-Aldrich) и 2 М KOH бяха използвани за разтваряне на вътреклетъчния продукт на формазан. Получената цветна реакция се измерва с четец на микроплаки при 630 nm (BIO-RAD, Финландия). Производството на ROS се изразява като микрограми формазан на 10 7 сперматозоиди. Получена е стандартна крива от известни концентрации на формазанов субстрат, разтворен в DMSO.

Анализ на митохондриалната активност

Митохондриалната активност на сперматозоидите е открита по метода, описан от Hrudka 54. Накратко, спермата се разрежда 1: 3 в PBS с 1 mg/ml 3,3-диаминобензидин (DAB) след втечняване на спермата и след това се прехвърля в инкубатор за 1 h при 37 ° C. Към предметното стъкло се добавя 10 μl намазка. След това изсушеното на въздух пързалка се фиксира с 10% формалдехид за 10 минути. За всяка проба бяха преброени точно 500 сперматозоиди с помощта на микроскоп Olympus BX51. Сперматозоидите са класифицирани въз основа на оцветената дължина на средния апарат. Класове от I до III съответстват съответно на 100%, повече от 50% и по-малко от 50% от оцветения среден апарат. Клас IV не е имал оцветяване в средния апарат.

Определяне на фрагментацията на ДНК

Използван е комплект за дисперсия на сперматозоидна хроматин (SCD), за да се открие степента на фрагментация на ДНК в спермата в съответствие с препоръките на производителя (BRED, Life Science Technology Inc., Шенжен, Китай) Накратко, 60 μl от разредената проба от сурова сперма се добавят към епруветка на Eppendorf и се смесват напълно с разтопена агароза, загрята при 80 ° C в продължение на 20 минути. Точно 30 μl от сместа се добавят към предварително покрития предмет и пързалката се охлажда при 4 ° С в продължение на 5 минути. Плъзгачът се инкубира в разтвор А за 7 минути и разтвор В за 25 минути и след това се промива в дестилирана вода за 5 минути. След третиране с дехидратация чрез поредица от концентрации на етанол (70–90–100%), предметното стъкло се инкубира в смес от разтвор на Райт и PBS в продължение на 16 минути. След това пързалката беше измита и изсушена на въздух. За всяка проба бяха преброени точно 500 сперматозоиди с помощта на микроскоп Olympus BX51. Сперматозоидите с големи или средни ореоли се считат за не фрагментирани, докато сперматозоидите с малки ядра или без ореоли съдържат фрагментирана ДНК.

статистически анализи

Демографските данни са представени като средството ± SD за двете групи. Тестът за нормалност на Колмогоров – Смирнов е използван за изследване на отклоненията от нормалните разпределения. Тестът на Student's t се използва за анализ на нормално разпределени данни, а тестът Mann-Whitney U се използва за анализ на непараметрични данни. За анализ на качествени данни е използван тест с хи-квадрат. За оценка на връзката между STL и ИТМ на пациента е използван общ модел на линейна регресия. Използвана е многовариантна логистична регресия, за да се изследва дали мъжкият ИТМ влияе върху клиничната бременност след коригиране на женския ИТМ, възрастта на жената, броя на прехвърлените ембриони, базалните нива на FSH, възрастта на мъжете и броя на сперматозоидите за групата с наднормено тегло. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуера SPSS Версия 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Стойност на P (126K, pdf)

Благодарности

Бихме искали да благодарим на всички пациенти, участвали в това проучване. Тази работа е финансирана от безвъзмездни средства от Националната фондация за естествени науки на Китай (грантове 31271605 и 31471404 за Yingpu Sun), Национална научна фондация за млади учени от Китай (грант 31401274 за Qingling Yang) и Младежки иновационен фонд на първата свързана болница на университета в Джънджоу (до Qingling Yang).