От Центъра за експериментална терапия и Катедра по фармакология, Университет в Пенсилвания, Медицински факултет, Филаделфия.

От Центъра за експериментална терапия и Катедра по фармакология, Университет на Пенсилвания, Медицински факултет, Филаделфия.

От Центъра за експериментална терапия и Катедра по фармакология, Университет в Пенсилвания, Медицински факултет, Филаделфия.

От Центъра за експериментална терапия и Катедра по фармакология, Университет на Пенсилвания, Медицински факултет, Филаделфия.

От Центъра за експериментална терапия и Катедра по фармакология, Университет на Пенсилвания, Медицински факултет, Филаделфия.

От Центъра за експериментална терапия и Катедра по фармакология, Университет на Пенсилвания, Медицински факултет, Филаделфия.

Преглеждате най-новата версия на тази статия. Предишни версии:

Резюме

Заден план- Атеросклерозата е сложно съдово възпалително заболяване. Аспиринът с ниски дози е основата на профилактиката на съдовите усложнения на атеросклерозата. Искахме да определим ефекта на ниските дози аспирин върху съдовото възпаление, състава на плаката и атерогенезата при мишки с дефицит на LDL рецептори, хранени с диета с високо съдържание на мазнини.

Методи и резултати— При мишки с дефицит на LDL рецептор, хранени с диета с високо съдържание на мазнини в сравнение с контролни мишки, ниските дози аспирин предизвикват значително намаляване на нивата на циркулация и съдово образуване на разтворима междуклетъчна молекула-1, моноцитен хемоаттрактант протеин-1, фактор на туморна некроза-α, интерлевкин -12p 40, без да повлиява нивата на липидите. Това е свързано със значително намаляване на активността на ядрения фактор κB в аортата. Ниските дози аспирин също значително намаляват степента на атеросклероза. И накрая, аортните съдови лезии на третираните с аспирин животни показват 57% намаление (P 1 Терапевтичният ефект на аспирина обикновено се дължи на неговата тромбоцитна инхибиторна функция. 2,3 Дали аспиринът има in vivo по-задълбочено и сложно действие, особено върху кръвоносните съдове, остава да бъде напълно изяснен. Последното десетилетие се характеризира с все повече доказателства, че атеросклерозата е възпалително заболяване на съдовата система. 4 По този начин циркулиращите нива на възпалителни маркери предсказват риска от сърдечно-съдови събития при атеросклеротично заболяване, 5 а приемът на аспирин намалява тези нива и риска от съдови събития. 6 По-рано показахме, че индометацинът, аспириноподобно лекарство, потиска биосинтеза на тромбоксан (Тх) А2 и намалява атеросклерозата. 7 В това проучване индометацин също значително намалява простациклин (PGI2), който има противовъзпалителна активност in vitro. Той инхибира активирането на тромбоцитите, левкоцитно-адхезивните взаимодействия и миграцията и пролиферацията на съдови гладкомускулни клетки, механизми, които всички могат да имат антиатерогенен ефект. 8 Доколкото ни е известно, ефектът на аспирина и други противовъзпалителни лекарства върху съдовия възпалителен компонент на атерогенезата и състава на плаката не е известен.

Настоящите изследвания са предназначени да отговорят на два въпроса. Първо, искахме да определим дали ниските дози аспирин имат някакъв ефект върху съдовото възпаление по време на атерогенезата. Второ, искахме да определим ефектите от тази фармакологична интервенция върху състава на плаката при мишки с дефицит на LDL рецептор (LDLR -/-) на диета с високо съдържание на мазнини. Дългосрочното приложение на аспирин значително намалява съдовите възпаления и аортните атеросклеротични лезии. Освен това намалява съдържанието на макрофаги в пяна, но увеличава количеството колаген и броя на гладкомускулните клетки, присъстващи в атеросклеротичните плаки. Тези открития показват, че аспиринът проявява мощен антиатерогенен ефект не само чрез инхибиране на тромбоцитното активиране, но и чрез потискане на съдовото възпаление и повишаване на стабилността на плаката.

Методи

Животни

LDLR -/- мишки (обратно кръстосани 10 пъти до мишки C57BL/6) са получени от Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) на 6-седмична възраст. Всички процедури и грижи за животните са одобрени от IACUC на университета в Пенсилвания. След 2 седмици аклиматизация, те бяха хранени с диета с високо съдържание на мазнини (нормална чау, допълнена с 0,15% холестерол и 20% маслена мазнина) за цялото проучване. По това време животните бяха разделени на 2 групи (n = 14 всяка) и рандомизирани да получават плацебо или аспирин (30 mg/L) в питейната си вода, която се заменяше с прясна вода през ден. Като се има предвид, че всяко животно пие средно 3 до 4 ml вода на ден, това би било равно на 90 до 120 μg аспирин на ден за мишка с тегло 30 g. В скала, коригирана по телесна скала, това количество би било равно на 180 до 240 mg/ден, ако животните тежат 60 kg. Урината и плазмата се събират преди началото на аспирина (изходно ниво, 8-седмична възраст) и в края на проучването (26-седмична възраст), както е описано по-рано. 7,9

COX-1 Дейност Ex Vivo

Активността на COX-1 ex vivo се оценява чрез измерване на серумен TxB2 и агрегация на тромбоцити, индуцирана от арахидонова киселина (100 цМ), както е описано по-горе. 7,9

Биохимични анализи

Серум TxB2, 2,3-динор TxB2 и 2,3-динор 6-кето PGF1α се измерват чрез анализи с газова хроматография/масспектрометрия, както е описано по-горе. 7,9 Плазмените нива на холестерол и триглицериди се определят ензимно чрез използване на реагенти Sigma (Sigma Chemical Co). Разтворимите междуклетъчни адхезионни молекули-1 (sICAM-1), моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1), фактор на туморна некроза-α (TNF-α) и нива на интерлевкин-12 p40 (IL-12p40) са измерени чрез ELISA комплекти, следвайки инструкциите на производителя (Pierce Endogen).

Аортна формация на цитокини

След като мишките бяха убити, аортното дърво беше перфузирано с PBS, съдържащ EDTA (2 mmol/L) и бутилиран хидрокситолуен BHT (20 μmol/L), pH 7.4, чрез вкарване на канюла в лявата камера и позволяване на свободно изтичане от разрез в долната куха вена. След отстраняване на заобикалящата адвентициална мастна тъкан гръдната аорта се отделя от дъгата и коремните области. Един сантиметър от гръдната аорта (n = 5) се нарязва и се инкубира в среда без серум при 37 ° С за 24 часа, с леко разклащане. В края на инкубационното време супернатантите се събират и се анализират за нива на цитокини.

Анализ на изместване на електрофоретичната мобилност

Ядрените екстракти от миши аорти (коремни области) се дисоциират с помощта на хоросан и пестик и се екстрахират с NE-PER реактори за ядрена и цитоплазмена екстракция (Pierce Chemical Co). Концентрациите на протеини се определят по метода на Брадфорд (Bio-Rad Laboratory). Двуверижният ядрен фактор-кВ (NF-кВ) консенсусен олигонуклеотид (5′-AGTTGAGGGGGA-CTTTCCCAGGC-3 ′), (Promega Corp, Madison, Wis) е използван като сонда след 5′-крайно маркиране и пречистване. Реакциите на свързване се извършват, както следва: ядрените екстракти (10 μg протеин) се инкубират с радиомаркирани ДНК сонди (70 fmol, 2,5 × 10 4 cpm) при стайна температура за 30 минути в 20 μL свързващ буфер (4% глицерол; 1 mmol/L MgCl2; 0,5 mMEDTA; 0,5 DTT; 50 mmol/L NaCl; 10 mmol/L трис-HCI, рН 7,5; 0,05 mg/ml поли dI-dC). Към реакцията при 50-кратен моларен излишък се добавя конкуриран немаркиран олигонуклеотид. За анализи на свръхсменни проби пробите бяха инкубирани с анти-p50, anti-p65, anti-C-Rel или анти-p52 заешки поликлонални антитела (Santa Cruz Biothecnol, Santa Cruz, Calif). Продуктите от реакцията на свързване се електрофорезират през 5% неденатуриращи полиакриламидни гелове в 1 × TB буфер. Геловете бяха изсушени и анализирани чрез авторадиография. Анализите винаги се извършват по заслепен начин.

Подготовка на миши аорти и количествено определяне на атеросклероза

След окончателното вземане на кръв мишките бяха убити и аортното дърво беше перфузирано в продължение на 10 минути с ледено студен PBS, както беше описано по-рано. 7,9 Аортата се отваря надлъжно от корена на аортата до бифуркацията на илиачната кост, фиксирана във формално-захароза (4% параформалдехид, 5% захароза, 20 μmol/L BHT и 2 mmol/L EDTA, pH 7,4), след това се оцветява с Судан IV (n = 9). Степента на атеросклероза се определя с помощта на метода en face. 7,9 Атеросклерозата също е количествено определена в напречните сечения на аортния корен от прясно замразени сърца, вградени в ОСТ, както беше описано по-рано. 9 Накратко, редуващи се 10-μm замразени участъци върху аортния корен, покриващи 300 μm от проксималната аорта, започвайки от синуса, бяха фиксирани в ацетон, рехидратирани и оцветени за атеросклеротични лезии с маслено червено O. Изображенията бяха заснети цифрово и винаги анализирани по заслепен начин, както беше описано по-рано. 7,9

Хистология и имунохистохимия

Статистически анализ

Таблица 1113380. Телесно тегло, плазмен холестерол, триглицериди, серумен TxB2, индуцирана от арахидонова киселина агрегация на тромбоцити, нива на 2,3dinorTxB2 и 2,3dinor 6keto PGF1α в LDLR -/- Мишки на 8 седмици на възраст (основа) и след 18 седмици на седмица Диета с високо съдържание на мазнини (окончателна), със или без аспирин с ниска доза (n = 14 животни за всяка група)

Съдови възпалителни отговори

За да изследваме съдовите възпалителни отговори, свързани с атерогенезата при LDLR -/-, извършихме два комплекта експерименти. Първо, определихме нивата на циркулация на няколко възпалителни цитокини, които са участвали в атеросклерозата. 12 В края на проучването, LDLR -/- мишки (n = 10 за всяка група) на диета с високо съдържание на мазнини са имали значително увеличение на sICAM-1 (5,1 ± 1 срещу 13,5 ± 1,2 ng/ml, P

ниски

Фигура 1. Производството на цитокини се намалява от ниски дози аспирин. Аортите се инкубират за 24 часа в безсерумна среда при 37 ° С. В края на инкубационното време супернатантите бяха събрани и анализирани за s-ICAM-1, MCP-1, TNF-α и IL-12p40 чрез ELISA (n = 5 за всяка група, *P

За да изследваме молекулярните последици от този режим на терапия in vivo, потърсихме доказателства за модулация на NF-κB, тъй като този транскрипционен фактор е свързан с модулацията на гените на съдовия възпалителен отговор. 13 мишки бяха убити в края на проучването; аортите бяха събрани и ядрените екстракти бяха изолирани и анализирани за NF-κB свързваща активност. Резултатите от теста за промяна на подвижността на гела показват функционалното присъствие на този фактор в аортни ядрени екстракти от 26-седмични LDLR -/- мишки на диета с високо съдържание на мазнини, като се използва сонда за консенсусна последователност NF-κB (Фигура 2). Това беше значително намалено (34%) в пробите от ядрен екстракт от третирани с аспирин животни (Фигура 2). Идентичността на NF-кВ лентата е проверена чрез състезателни проучвания, при които 50-кратно излишък на немаркирана NF-кВ сонда напълно блокира NF-кВ свързващата активност (Фигура 2). Проучванията със свръхсмяна с антитела срещу р65 и р50 и инкубация с анти-р52 и анти-C-Rel допълнително потвърждават специфичността на NF-κB свързващата активност (Фигура 2).

Фигура 2. NF-κАктивността на В е намалена в аортите от третирани с аспирин LDLR -/- мишки. ДНК свързващата активност на ядрени екстракти (10 μg) от аорти на LDLR -/- върху плацебо или аспирин беше тествана с маркирана консенсусна сонда NF-κB при анализ на електрофоретична подвижност. Свързването се състезава чрез инкубация с 50-кратен излишък на немаркиран NF-κБ. Ядрените екстракти бяха свръхнаместени с антитела срещу p50, p65, C-Rel и p-52. Лентите за anti-p50 и anti-p65 са обозначени съответно със стрелка и двойна стрелка.

Анализ на аортна атеросклероза

Аортната атеросклеротична лезия е количествено определена чрез два независими метода, анализ на лицето и напречното сечение на проксималната аорта. Средният (среден процент) размер на аортната атеросклеротична лезия в плацебо групата е 14 ± 2,3% от общата аортна повърхност; това е значително намалено при третирани с аспирин мишки до 5,1 ± 1,1% (P= 0,001) (Фигура 3). Подобно на анализа на лицето, лечението с аспирин води до значително намаляване на анализа на напречното сечение на размера на лезията в сравнение с контролната група (565 670 ± 21 884 срещу 400 385 ± 22 557 μ 2/раздел, P= 0,03).

Фигура 3. Процент на общите зони на аортна атеросклеротична лезия при LDLR -/- мишки, на които се дава диета с високо съдържание на мазнини, получаващи плацебо или ниски дози аспирин в края на проучването (на възраст от 26 седмици) (n = 9 за всяка група, *P= 0,001).

Хистологични изследвания

След това, за да се изследва дали ниските дози аспирин оказват влияние върху състава на плаката, са извършени подробни хистологични изследвания, анализиращи макрофаги, гладкомускулни клетки и съдържание на колаген. Това лечение намалява процента на положителна площ за макрофаги с 57% (P

Фигура 4. Представителна зона на поражение на аортния синус на атеросклеротични LDLR -/- мишки. Микрофотографии: Напречни сечения на аортния корен при LDLR -/- мишки, на които се прилага диета с високо съдържание на мазнини, получаващи плацебо (десен панел) или ниски дози аспирин (ляв панел). Секции бяха оцветени за липидни лезии (маслено червено O) (Oro), имунооцветени за съдържание на макрофаги, гладки мускулни клетки (SMC) или колаген (C).

Фигура 5. Ефекти на ниски дози аспирин върху съдържанието на лезии в макрофаги (A), гладкомускулни клетки (B) и колаген (C) при LDLR -/- мишки (n = 10 за всяка група, *P

Дискусия

Въпреки че високите дози аспирин инхибират активирането на NF-kB in vitro, 23-25 ​​установихме, че ниските дози аспирин намаляват това активиране in vivo. Няколко аспекта разграничават нашето проучване от повечето разследвания по този въпрос. Повечето от тях са извършени in vitro чрез използване на един клетъчен тип, високи дози аспирин и най-важното, еднократно точково наблюдение, което би било равно на остър ефект на лекарството. И обратно, използвахме сложна клетъчна система (мишка) и много по-ниско количество аспирин, но дългосрочно перорално приложение, което би било равно на хроничен ефект на лекарството. Всички тези съображения биха могли да обяснят различните резултати. Въпреки това спекулираме, че наблюдаваното намаляване на съдовата активност на NF-κB не може да зависи пряко от фармакологичното действие на аспирина, а от вторично събитие.

През последните години стана очевидно, че съставът на атеросклеротичната плака заедно с нейната податливост на руптура са два важни аспекта на заболяването. 26 Тук за първи път съобщаваме, че ниските дози аспирин имат значителен ефект върху състава на плаката. Той увеличава броя на гладкомускулните клетки и съдържанието на колаген, но намалява пенестите клетки в аортните атеросклеротични лезии. Тези открития категорично предполагат, че лечението с аспирин води до развитието на по-стабилен фенотип на плаката. В настоящото изследване не можем да правим разлика между директен ефект на аспирина върху състава на плаката и вторичен ефект върху плаката поради неговата антиатеросклеротична активност. По-рано обаче показахме, че индометацин редуцира макрофагите, но не влияе върху съдържанието на гладкомускулни клетки в атеросклеротичните лезии. 7,10 Освен това е известно, че намаляването на атеросклерозата (размера на лезията) не отговаря непременно на по-стабилен фенотип. 7,10

В обобщение, нашите проучвания показват, че аспиринът, освен антитромбоцитното си действие, може да има допълнителни in vivo свойства върху васкулатурата, които също могат да допринесат за неговия антиатерогенен ефект. Те включват потискане на съдово възпаление и развитие на по-малки атеросклеротични лезии, които съдържат повече колаген и гладкомускулни клетки и по-малко макрофаги и холестерол, в съответствие с по-стабилен фенотип на плаката. Потенциално ограничение на нашето проучване е, че въпреки сходството на нашия аспиринов режим с човешкото състояние на приложение на ниски дози аспирин, има аспекти, които трябва да бъдат взети предвид, преди резултатите ни да бъдат пренесени върху човешката атеросклероза. Първо, фармакокинетиката на аспирина при мишки може да се различава от тази при хората; второ, докато хората получават веднъж дневно, животните в нашето проучване са имали многократни дневни дози. Като се има предвид съществуването на сравнително малко литература за ефекта на това лекарство върху атеросклерозата, 27,28 нашите наблюдения показват, че преоценката на аспирина при прогресията на атеросклеротичната плака и състава при хората е навременна.

Д-р Пратико би искал да посвети това произведение на паметта на баща си Алфредо. Тези проучвания са подкрепени с безвъзмездни средства от Националния здравен институт (HL-54500 и HL-61364) и Американската сърдечна асоциация (03021N). Благодарим на Garret A. FitzGerald за полезна дискусия.