Субекти

Резюме

Имунната функция на слезката се подобрява при мишки, предизвикани от диета (DIO), причинени от Ешерихия коли. Промените във функцията на далака при апоптоза все още са неизвестни. Двеста мишки в групи постно-Е. coli и DIO-Е. coli са били интраназално вливане на Е. coli. И още двеста мишки в групи Lean-PBS и DIO-PBS получиха буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS). Впоследствие се анализира хистологията на далака. След това скоростите на апоптоза на далачните клетки (SC) и експресията на гените и протеините на Bcl-2, Bax, каспаза-3 и каспаза-9 бяха количествено определени във всяка група на 0 h (незаразени), 12 h, 24 h, и 72 h постинфекция. Скоростите на апоптоза на SC на DIO-Е. coli групите са по-ниски от тези на DIO-PBS групите на 12, 24 и 72 часа (стр

Въведение

Затлъстяването е сложно метаболитно състояние, което влияе върху няколко физиологични системи, включително имунната функция. Промените в една от тези физиологични системи самостоятелно или в комбинация могат да повлияят драстично отговора на белите дробове към възпалителни стимули 1. Затлъстяването увеличава податливостта на хората към бактериални инфекции, тежки заболявания и смърт, причинени от бактериално причинено нараняване на белите дробове 2,3 .

Интересното е, че последните проучвания показват, че затлъстяването играе защитна роля при пневмония 4,5. Предварителното проучване на Gu съобщава, че затлъстяването може да облекчи окислителното увреждане и възпалението на далака при мишки при условие на нефатална остра пневмония, предизвикана от Ешерихия коли 6. Тези резултати предполагат, че затлъстяването може да подобри имунния отговор на далака на мишки срещу белодробна инфекция.

Апоптозата е важен процес за нормалното развитие и поддържане на хомеостазата на гостоприемника в многоклетъчните организми 7,8. Той може да бъде иницииран или инхибиран от различни стимули на околната среда, както и от физиологични и патологични състояния (например оксидативен стрес) 9. Апоптозата засяга стабилността на имунната система чрез регулиране на генната експресия и/или протеинова активност 9. Затлъстяването и инфекцията могат да предизвикат апоптоза на клетките на далака (SC). Например, Уанг и др. 10 съобщават, че мишките, хранени с високомаслена диета (HFD), са имали повишена апоптоза на Т-регулаторните клетки в далака в сравнение с тази при контролните мишки, тази експресия на свързан с В-клетъчен лимфом-2 X протеин (Bax) и каспаза-3 е увеличен и че експресията на В-клетъчен лимфом (Bcl) -2 е намалена при мишки, групирани от диета, предизвикани от затлъстяване (DIO). Освен това е установено повишена апоптоза на SC в третираните с липополизахарид (LPS) плъхове и че експресията на Bcl-2 намалява и експресията на Bax се увеличава 11 .

Далакът е най-големият имунен орган при хората. Той участва в хуморални и клетъчни имунни отговори чрез ролята си в генерирането, узряването и съхранението на лимфоцитите 12. Промените в апоптозата на SC могат да повлияят на имунния отговор на затлъстелите хора, страдащи от бактериална инфекция.

До този момент има много малко информация за апоптозата на SC между затлъстели и нормални мишки, които са Е. coli инфекция. За да запълним тази празнина в знанията, наблюдавахме патологичната хистология на далака и измервахме скоростта на апоптоза и експресия на свързани с апоптозата гени и протеини (Bcl-2, Bax, каспаза-3, каспаза-9) при мишки с Е. coli инфекция. Нашите резултати могат да предоставят нови експериментални доказателства за разбиране на апоптозата на клетките на далака при индуцирани от диета мишки със затлъстяване при нефатална остра пневмония, индуцирана от Е. coli инфекция.

Материали и методи

Етично одобрение на протокола за изследване

Протоколите за грижите и изследването на животните бяха одобрени от Насоки за грижа и употреба на лабораторни животни (Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ) и Комитета по етика на Съчуанския земеделски университет (Ченгду, Китай), съответно. Всички методи са извършени в съответствие със съответните насоки и разпоредби.

Лечение на опитни животни

Четиристотин мъжки мишки кунмин (3 седмици) са закупени от Dashuo Animals (Ченгду, Китай) и са настанени при специфични условия, свободни от патогени. По време на експериментирането мишките имаха достъп ad libitum до стерилни търговски диети от Dashuo Animal Center (Ченгду, Китай) за 8 седмици 4,13. Температурата на околната среда се поддържаше на 22–24 ° C и мишките бяха подложени на 12-часов цикъл светлина-тъмнина. След 1 седмица на аклиматизация към тяхната среда, мишките бяха разделени на случаен принцип в две групи: Lean (n = 200) и DIO (n = 200). Теглото на тялото на мишките във всяка група хранене се измерва всяка седмица, чрез което DIO мишки могат да бъдат получени след 8 седмици 4 .

Е. coli

Е. coli е получена от ветеринарната медицинска лаборатория на земеделския университет в Съчуан (Ченгду, Китай). Преди това демонстрирахме, че мишките са заразени с Е. coli (4 × 10 9 CFU/ml) чрез интраназалният път имаше типично белодробно възпаление, но не умря. Е. coli се култивира при 37 ° С в продължение на 20 часа в лизогенна бульонна среда, за да се получи бактериална течност. Последният беше центрофугиран и суспендиран в PBS за получаване на инокула.

Интраназална инфекция

Мишките бяха разделени допълнително на четири групи: Lean-PBS (n = 100), Lean-Е. coli (n = 100), DIO-PBS (n = 100) и DIO-Е. coli (п = 100). Мишки от постно-Е. coli и DIO-Е. coli групи, подложени на интраназално вливане с 40 μL суспензия, съдържаща

10 9 CFU от Е. coli. На мишки от Lean-PBS и DIO-PBS групи се дава същата доза от PBS 4,5. Бяха отстранени две мишки, които умряха в рамките на 6 часа след интраназалното вливане.

Хистопатология и оцветяване

На 0 h (неинфектирани), 12 h, 24 h и 72 h postinfection, осем мишки от всяка група бяха умъртвени, тъканите на далака бяха анализирани и фотографирани. Тъканите на далака се фиксират в 4% параформалдехид и се обработват рутинно в парафин. След това те бяха дехидратирани, вградени в парафин, разделени (дебелина, 4

Подготовка на спленоцити

На 0 часа (преди инфекция), 12 часа, 24 часа и 72 часа (след инфекция), изрязаните далаци се превръщат в клетъчни хомогенати и се центрофугират при 1000 × ж за 5 минути при 4 ° С, за да ги утаи. Клетъчните концентрации бяха коригирани до

10 6/mL чрез PBS и се съхраняват при 4 ° С. След това 5 µL анексин V-флуоресцеин изотиоцианат (V-FITC; 51-66121E; BD Pharmingen, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и пропидиев йодид (PI; 5 µL) бяха добавени към 100 µL от клетъчните суспензии. След това суспензиите на далачните клетки се инкубират в продължение на 15 минути при 22 ° С на тъмно. 400 μL свързващ буфер (BD Pharmingen, САЩ, 559763) бяха добавени към клетъчните суспензии. След това клетъчните суспензии се смесват с вихрови трептения.

Определяне на скоростта на апоптоза чрез поточна цитометрия

На 0 h (неинфектирани), 12 h, 24 h и 72 h postinfection, осем мишки от всяка група бяха умъртвени, тъканите на далака бяха анализирани. Скоростите на апоптоза в далака бяха изследвани чрез поточна цитометрия, използвайки BD FACSCalibur ™ (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния, САЩ) в рамките на 1 час. Активирано с флуоресценция сортиране на клетки се извършва с размер на пробата от 10 000 клетки, затворени въз основа на разсейване напред и отстрани. Данните се съхраняват и обработват с помощта на Flowjo (BD Biosciences).

Количествена верижна реакция на полимераза в реално време (qRT-PCR)

На 0 h (неинфектирани), 12 h, 24 h и 72 h postinfection, осем мишки от всяка група бяха умъртвени, тъканите на далака бяха анализирани. Експресията на гени в тъканите на далака се измерва с помощта на qRT-PCR. Обща РНК се изолира от далака, използвайки RNAiso Plus (9108/9109; Takara Bio, Токио, Япония). Безплатна (c) ДНК се синтезира от общата РНК в далака чрез реактивен комплект PrimeScript ™ RT (RR047A; Takara Bio) съгласно инструкциите на производителя. И тогава, cDNA беше използвана като шаблон за qRT-PCR анализ. За qRT-PCR реакции са направени 10 μL смеси с помощта на SYBR ® Premix Ex Taq ™ II (DRR820A, Takara Bio), съдържащи 5 μL Tli RNaseH Plus, 0,4 μL преден и 0,4 μL обратен праймер, 3,4 μL без РНКаза вода и 0,8 μL сДНК. Генетичните експресии на Bax, Bcl-2, Caspase-3 и Caspase-9 бяха количествено определени, β-актин (Sangon Biotech, Shanghai, China) беше използван като вътрешен стандарт.

Използвани бяха следните праймери на мишката (съответно напред и назад): Bcl-2 AGCCTGAGAGCAACCCAAT и AGAGGATGACCACCACAAAG; Bax, ATGCGTCCACCAAGAAGC и CAGTTGAAGTTGCCATCAGC; каспаза-3, ACATGGGAGCAAGTCAGTGG и CGTCCACATCCGTACCAGAG; каспаза-9, GAGGTGAAGAACGACCTGAC и AGAGGATGACCACCACAAAG; β-актин, TGCTGTGTTCCCATCTATCG и TTGGTGACAATACCGTGTTCA.

Тези генни праймери са проектирани от Primer 5 и получени от Sangon Biotech. Условията за колоездене бяха: 95 ° C за 3 минути, последвани от 44 цикъла от 10 s при 95 ° C, 30 s при 60 ° C и 10 s при 72 ° C. Колоезденето беше направено с помощта на LightCycler ® 480 в реално време PCR система (Roche, Базел, Швейцария). Стенограмите се определят количествено по метода 2 ΔΔCt.

Уестърн блотинг

На 12 h постинфекция, три мишки от всяка група бяха умъртвени, тъканите на далака бяха наблюдавани. Тъканите на далака се лизират и протеините се екстрахират с RIPA лизисен буфер. След това общите лизати на далака се разделят чрез електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел, като се използват 12% гелове и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани за 30 минути в електрофоретични трансферни клетки. Впоследствие тези нитроцелулозни мембрани бяха блокирани в 2% обезмаслено сухо мляко за 1 h и инкубирани за една нощ при 4 ° C с първичните антитела Bax (ab32503), Bcl-2 (ab182858), каспаза-3 (ab184787) и каспаза- 9 (ab202068), които всички бяха от Abcam (Кеймбридж, Великобритания). Нитроцелулозните мембрани се измиват три пъти (по 15 минути) с TBS-Tween (TBST) и се инкубират с вторични антитела (7074; Cell Signaling Technology, Danvers, МА, САЩ) за 1,5 часа и се промиват три пъти (по 15 минути) с TBST. Петната се визуализират с ECL TM хемилуминесцентен реагент (технология Beyotime, P0018A) и се улавят върху рентгеновия филм. Експресията на протеин беше обработена с помощта на Image-Pro ® Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA).

статистически анализи

Значимостта на разликата между две групи е анализирана от независимите проби т тест, докато значителните разлики между четири групи в рамките на 72 часа експеримент бяха анализирани чрез дисперсионни анализи (LSD или Dunnett’s T3). Резултатите са изразени като средни стойности ± стандартно отклонение. Анализите бяха извършени с помощта на софтуера SPSS 17.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA) за Windows. Статистическата значимост беше разгледана при стр

Резултати

Хистопатология на далака

Далаци постно-Е. coli групи и DIO-Е. coli групите са имали нормална хистология с прозрачна бяла пулпа и червена пулпа на 0 h, но в DIO са открити слаба хиперемия на червената пулпа-Е. coli групи (фиг. 1). В 12 часа зоните на червения мозък на Lean-Е. coli групите бяха задръстени. В районите броят на многоядрените гигантски клетки се е увеличил, разположението на белите мозъчни лимфоцити е било хлабаво и възлите на далака са празни. Докато червеният мозък области на DIO-Е. coli групите бяха претоварени и в районите имаше макрофаги и многоядрени гигантски клетки. На 24 часа бяха открити малки количества плазмени клетки, неутрофили, макрофаги, мегакариоцити и вакуоли в пределната област на далака-Е. coli групи. И вакуоли бяха открити в синусите на далака. На 72 часа слезката на Lean-Е. coli групи и DIO-Е. coli групи показаха хиперемия на червената пулпа.

вливане

Промени в хистологичната структура на далаците на мишки. Разрезите на далака бяха наблюдавани чрез светлинна микроскопия, за да се изследва архитектурата на далака. N = 8 мишки на група. Мащабна лента = 20 μm.

Скорости на апоптоза на SC чрез поточна цитометрия

Скоростите на SC апоптоза бяха тествани чрез откриване на общия процент на ранни (анексин-V-положителни и PI-отрицателни) и късни (анексин-V-положителни и PI-положителни) апоптотични клетки с помощта на поточна цитометрия. Процентът на апоптоза на SC в групите DIO-PBS е бил значително по-висок от този на групите Lean-PBS през всички времеви точки (стр Фигура 2

Апоптоза на SC чрез анализ на TUNEL

Както е показано на фиг. 3, апоптотични клетки с кафяво оцветени ядра са открити в далака чрез TUNEL анализа. А апоптотичните клетки показаха ядрена кондензация и неправилни форми.

Хистология на SC с използване на TUNEL анализа. Апоптотични клетки с кафяво оцветени ядра бяха открити в далаците на мишки чрез анализа TUNEL, с ядрена кондензация и неправилни форми. Снимките са направени на 400× увеличение. N = 8 мишки на група. Мащабна лента = 20 μm.

Експресия на иРНК на bcl-2, bax, каспаза-3 и каспаза-9 чрез qRT-PCR

Според qRT-PCR, експресията на проапоптотичния ген Bax на DIO-групите е била по-висока от тази на Lean-групите съответно на 0 h (стр Фигура 4

Експресия на протеините на bcl-2, bax, каспаза-3 и каспаза-9 чрез Western blot

Както е показано на фиг. 5, за 12 h, експресии на Bcl-2 протеин на постно-Е. coli групите са по-ниски от тези на Lean-PBS групи и експресиите на Bcl-2 протеин на DIO-Е. coli групите са по-високи от тези на DIO-PBS групите (стр Фигура 5

Дискусия

Затлъстяването е хронична, нискостепенна възпалителна реакция и влияе върху неспецифични и специфични имунни отговори, медиирани от хуморални и клетъчно-медиирани механизми 15. Далакът, като най-големият периферен лимфен орган при хората и гризачите, е от основно значение за ефективното функциониране на имунния отговор 16,17. Далакът може да синтезира антитела в бялата си пулпа и да премахне покрити с антитела бактерии и покрити с антитела кръвни клетки чрез кръвообращението на кръвта и лимфните възли. Следователно, промените в структурата на далака засягат имунния статус на гостоприемника.

Документирана е значителна връзка между приема на HFD и дезорганизацията на далака при мишки 18. Ямано и др. 19 отбелязват повишен процент на далачна червена пулпа и макрофаги при мишки, хранени с HFD, а елементарното желязо се отлага главно в червената пулпа. По време на спленомегалия, много имунни клетки се освобождават, за да участват в имунната защита, когато гостоприемникът е заразен 11,20. В настоящото проучване структурите на далака показват разлики между различните групи на лечение. Структурната дезорганизация поради съпътстващи заболявания (затлъстяване и инфекция) може да промени микросредата в далака, която след това показа различни имунни отговори при Lean-мишки и DIO-мишки 18. Ще направим допълнителна проверка в следващия тест.

Наличност на данни

Няма налични допълнителни непубликувани данни. Всички автори споделят данните, залегнали в констатациите на техните ръкописи. Споделянето на данни позволява на изследователите да проверят резултатите от дадена статия, да възпроизведат анализа и да извършат вторични анализи.

Препратки

Mancuso, P. Затлъстяване и възпаление на белите дробове. J. Appl. Физиол. 108, 722–728 (2010).