Хонг-лианг Джанг

1 Катедра по фармация, Първа свързана болница на Медицински университет Гуангси, Нанин

2 Основен изследователски център за регулиране на черния дроб за хиперлипемия SATCM/Ниво 3 Лаборатория за липиден метаболизъм, Гуангдонг TCM Ключова лаборатория за метаболитни заболявания, Фармацевтичен университет Гуангдонг

Сяо-бин Чжун

1 Катедра по фармация, Първа свързана болница на Медицински университет Гуангси, Нанин

Yi Tao

3 HEC Pharm Group, Dongguan

Si-hui Wu

4 Катедра по фармация, Професионално техническо училище за храни и лекарства в Гуангдонг, Гуанджоу, Китай

Джън-куан Су

2 Основен изследователски център за регулиране на черния дроб за хиперлипемия SATCM/Ниво 3 Лаборатория за липиден метаболизъм, Гуангдонг TCM Ключова лаборатория за метаболитни заболявания, Фармацевтичен университет в Гуангдонг

Резюме

Предназначение:

Това проучване определя ефектите на хитозана (CTS) и водоразтворимия хитозан (WSC) микрочастици (MPs) и наночастици (NPs) при плъхове със затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини.

Методи:

Плъховете бяха разделени на случаен принцип в осем групи: нормална диетична група (празната контрола), емулсионна група с високо съдържание на мазнини (отрицателната контрола), контролни групи CTS и WSC, групи CTS-MP и WSC-MP и CTS-NP и WSC-NP групи. Всички групи (с изключение на празната контролна група) са хранени с високомаслена диета в продължение на 4 седмици, за да се установи моделът на затлъстяването. Различни проби се прилагат перорално веднъж дневно на групите за лечение в продължение на 4 седмици.

Резултати:

Наблюдавано е значително по-ниско наддаване на тегло при групите WSC-MP и WSC-NP, както и при групите CTS-MP и CTS-NP, в сравнение с плъховете, на които се дава нормална диета и диета с високо съдържание на мазнини (P Keywords: затлъстяване, хитозан, водоразтворим хитозан, микрочастици, наночастици, остра токсичност

Въведение

Затлъстяването е нарастващ проблем, който води до значителна заболеваемост и смъртност от свързано с теглото заболяване и намалено качество на живот.1 Затлъстелите лица са по-склонни да развият артрит, белодробни заболявания, диабет, метаболитен синдром, хипертония и коронарна артериална болест, 3 и е по-вероятно да имат намалена продължителност на живота

Развитието на микро- и наномащабни системи е една от най-забележимите тенденции в много области на биомедицинските изследвания през последните няколко десетилетия.16 CTS наночастиците (CTS-NP) също са получили голямо внимание като носители на различни лекарства. 17 Въпреки това, ефектите на CTS микрочастиците (CTS-MP) и CTS-NP върху затлъстяването не са докладвани. В това проучване е изследван ефектът на CTS-MP и CTS-NP върху затлъстяването при плъхове. Доказателствата от in vitro проучвания показват, че CTS с по-малки размери на частиците имат по-добри способности за свързване на холестерола.18 За да бъде от значение за промишлеността, процесът трябва да бъде на ниска цена с висока производителност. Напоследък са приготвени много видове MP с тесно разпределение на частиците по размер и висок добив по метода на пулверизационното сушене.

В предишни доклади беше демонстрирано, че CTS-NP и WSC-NP са ефективни средства за понижаване на серумните нива на липидите при хиперлипидемия, индуцирана от диета с високо съдържание на мазнини при плъхове. 22,23 Настоящото проучване допълнително изследва ефектите на различните CTS-MP и CTS-NP при затлъстели плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Следователно, основната цел на това проучване е да се сравни ефектът за намаляване на теглото на CTS и WSC MPs и NPs с наличния в търговската мрежа CTS при затлъстели плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Освен това оценката на безопасността на народните представители и НП е друга цел на този доклад.

Материали и методи

Материали

CTS и WSC със средно молекулно тегло съответно 350 kDa и 210 kDa са закупени от Shandong Aokang Biotech Ltd (Shandong, China). Вискозитетът е под 200 cP, а стойностите на деацетилиране са съответно 96,2% и 85%. Общият набор от холестерол (TC), триацилглицерол (TG), липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-C) и липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL-C) са получени от Bio Sino Biotechnology and Science Inc (Пекин, Китай). Всички други реактиви и разтворители са с аналитично качество.

Подготовка и характеризиране

CTS-MP и WSC-MP бяха приготвени, използвайки техниката на сушене чрез пулверизиране. При разтваряне на CTS в оцетна киселина (1,0% обем/обем) се получава разтвор, съдържащ 2,5% (тегло/обем) CTS. WSC разтворът се приготвя чрез разтваряне на WSC в дейонизирана вода, като се получава разтвор, съдържащ 2,0% (тегло/обем) WSC. След това разтворите бяха изсушени чрез пулверизиране с помощта на Lab Spray Dryer L-117 (Laiheng Scientific Co, Ltd, Пекин, Китай) със стандартна дюза (0,7 mm). Скоростта на пулверизиращия въздушен поток е 10–15 L/минута, а скоростта на потока е 600 ml/час. Входната температура се контролира при 160 ° С. Температурата на изхода се определя от температурата на входа и относителните фактори, като скоростта на подаване на въздух и течност и варира от 80 ° C до 85 ° C. Морфологията на MP беше изследвана при сканираща електронна микроскопия (S-3700N; Hitachi High Technologies, Токио, Япония) при 10 kV. Размерът на частиците и разпределението на размера на MPs бяха определени с оразмерител на частици (Zetasizer ® 3000HS; Malvern Instruments Ltd, Malvern, Обединеното кралство).

CTS-NP беше приготвен по метод, докладван по-рано от групата на авторите. 22 Накратко, CTS беше разтворен в разтвор на оцетна киселина (1.0% обем/обем). След това триполифосфатът се разтваря в дестилирана вода (1.0 mg/ml). Наносуспензия се получава спонтанно (синя прозрачна суспензия) при добавяне на триполифосфатен воден основен разтвор към CTS воден разтвор при механично разбъркване (1000 rpm) при стайна температура. След това наносуспензията беше ротационно изпарена (Ротационен изпарител N-1000D-W; Eyela, Япония) до половината от първоначалния обем. Изсушаването чрез пулверизиране се извършва с Lab Spray Dryer L-117, като се използва стандартна дюза (0,7 mm). Регулируемите параметри включват входната и изходната температура, дебита на помпата за разтвор и частичния вакуум на аспиратора.

По същия начин WSC-NP се образува в резултат на сложни електростатични взаимодействия между положително заредените кополимери и отрицателно заредения триполифосфат при меки условия.23 Накратко, WSC и триполифосфатът се разтварят в пречистена вода. За приготвянето на WSC-NP, разтворът на WSC се разбърква (1000 rpm) при стайна температура (25 ° C). След това към системата се добавя триполифосфатен разтвор, като разбъркването продължава, за да завърши образуването на наночастици (синя прозрачна суспензия). След това наносуспензията беше изсушена чрез пулверизиране с помощта на Lab Spray Dryer L-117.

Размерът на частиците и разпределението на размера на NP са измерени с помощта на оразмерител на частици (Zetasizer 3000HS). Морфологията на наночастиците беше изследвана със сканираща електронна микроскопия (S-3700N) при 10 kV.

Животни

Тези експерименти са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към фармацевтичния университет в Гуангдонг (Гуанджоу, Китай). В тези експерименти са използвани мъжки плъхове Sprague – Dawley (на възраст 8 седмици в началото на диетичния период). Те са закупени от Лабораторията за китайска медицина за животни в Университета Гуанджоу (Гуанджоу, Китай). По време на експерименталния период животните са били настанявани по десет на клетка в лабораторното съоръжение за животни в помещение с контролирана температура и влажност с 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Всички плъхове бяха снабдени със стандартна храна за гризачи (Лабораторен център за животни в Гуангдонг, Гуанджоу, Китай) и им беше позволено да се аклиматизират за 1 седмица. След това плъховете бяха разпределени на случаен принцип в осем групи (n = 10): (1) нормална диетична група с мазнини (NF); (2) диетична група с високо съдържание на мазнини (HF); (3) CTS група; (4) CTS-MP група; (5) CTS-NP група; (6) WSC група; (7) WSC-MP група; и (8) WSC-NP група.

Групата NF е хранена със стандартна храна за гризачи ad libitum, а групата HF е получавала диета с високо съдържание на мазнини (основен фураж 70%, жълтък на прах 10%, свинска мас 12% и захар 8%), докато приключи проучването. Останалите групи са били хранени с високомаслена диета в продължение на 4 седмици, за да установят модела на затлъстяване. След това CTS, WSC, CTS-MP, WSC-MP, CTS-NP и WSC-NP (5.0 g) се диспергират в дестилирана вода (100 ml). Всяка проба (450 mg/kg) се прилага перорално веднъж дневно на групите за лечение в продължение на 4 седмици.

Телесно тегло, тегло на черния дроб и мастната тъкан и прием на храна

Състоянието на затлъстяване се наблюдава чрез измерване на телесното тегло и приема на храна, тъй като приемът на храна обикновено е по-висок при затлъстяване. Телесното тегло и приема на храна се записват веднъж седмично. В края на експерименталния период плъховете се гладуват цяла нощ и се вземат кръвни проби от орбиталната вена с помощта на капилярна тръба под етерна анестезия. След това плъховете бяха умъртвени и обезкостени. Черният дроб, епидидималната бяла мастна тъкан и периреналната бяла мастна тъкан бързо се отстраняват и претеглят. Парче черен дроб веднага се съхранява при -80 ° C за по-нататъшен анализ.

Измерване на липиди в серума и черния дроб

Липидите в серума и черния дроб се измерват с помощта на наличните в търговската мрежа комплекти (Bio Sino) съгласно препоръчаните протоколи. Плазмата се приготвя чрез центрофугиране и се анализира, използвайки налични в търговската мрежа комплекти.

Проучвания за остра токсичност

Острата орална токсичност на CTS и WSC MPs и NPs бяха оценени при плъхове, като се използва процедурата, описана от Националния стандарт за тест за остра токсичност GB 15193.3-1994 CN. Животните бяха разделени на контролни групи и шест третирани групи (CTS, CTS-MP, CTS-NP, WSC, WSC-MP и WSC-NP), с по 20 животни във всяка група (десет мъжки и десет женски). Всички животни бяха подложени на гладно 4 часа преди лечението. Контролните групи получават нормален физиологичен разтвор, а третираните групи получават 1000, 2150, 4640 и 10 000 mg/kg от определените проби. Животните се наблюдават в продължение на 1 час след третирането и след това се наблюдават периодично в продължение на 4 часа. След това плъховете се наблюдават допълнително до 14 дни след третирането. Смъртността, клиничните признаци и грубите находки на плъховете са наблюдавани и измервани в продължение на 14 дни след пероралното приложение на различни CTS MP и NP. Впоследствие животните бяха умъртвени чрез цервикална дислокация. Жизненоважни органи, включително черния дроб, белия дроб, далака, бъбреците и сърцето, бяха отстранени за макроскопски анализ.

Статистически анализ

Всички експериментални резултати бяха сравнени с еднопосочен дисперсионен анализ, използвайки IBM® SPSS 16.0 (SPSS, Inc, Чикаго, IL), а данните са изразени като средно ± стандартно отклонение. Разликите между средните стойности на групата бяха анализирани с помощта на теста на многобройния обхват на Student-Newman-Keuls P Фигура 1. Средното наддаване на тегло в групите CTS и WSC е съответно 68,99 g и 33,52 g. Значително по-малко наддаване се наблюдава при животни, хранени с различни MP (57,44 g са получени при тези, хранени с CTS-MP, и 21,13 g са получени при тези, хранени с WSC-MP) и NP (49,31 g са получени при тези, хранени с CTS-NP 25,73 g са получени при тези, хранени с WSC-NP) в сравнение с групите HF (121,25 g) и NF (113,81 g) (P Фигура 2), но не и сред групите за лечение.

хитозан

Ефекти от (A) хитозан и (Б.) водоразтворими микро- и наночастици от хитозан при прием на храна при плъхове (n = 10).

Съкращения: CTS, хитозан; CTS-MP, микрочастици на хитозан; CTS-NP, наночастици на хитозан; СН, диета с високо съдържание на мазнини; NF, нормална мастна диета; WSC, водоразтворим хитозан; WSC-MP, водоразтворими микрочастици на хитозан; WSC-NP, водоразтворими наночастици на хитозан.

Тегло на черния дроб и мастна тъкан

Крайното тегло на черния дроб и мастната тъкан на групите е показано на фигури 3 и и 4. 4. Чернодробното тегло е значително намалено в групата на CTS-MP в сравнение с групата с HF. Не се наблюдава разлика сред останалите групи (P> 0,05). Прилагането на CTS и WSC MPs и NP намалява крайното тегло на епидидимална бяла мастна тъкан и периренална бяла мастна тъкан в сравнение с HF и NF групите (P> 0,05). Групите CTS и WSC също показват намалено крайно тегло на мастните тъкани, но разликите не са статистически значими в сравнение с групата с HF (P> 0,05).

Ефекти на хитозан и водоразтворими микро- и наночастици на хитозан върху теглото на черния дроб при плъхове (n = 10).

Съкращения: CTS, хитозан; CTS-MP, микрочастици на хитозан; CTS-NP, наночастици на хитозан; СН, диета с високо съдържание на мазнини; NF, нормална мастна диета; WSC, водоразтворим хитозан; WSC-MP, водоразтворими микрочастици на хитозан; WSC-NP, водоразтворими наночастици на хитозан.

Ефекти на хитозан и водоразтворими микро- и наночастици на хитозан върху мастните тъкани при плъхове (n = 10).

Съкращения: CTS, хитозан; CTS-MP, микрочастици на хитозан; CTS-NP, наночастици на хитозан; СН, диета с високо съдържание на мазнини; NF, нормална мастна диета; WSC, водоразтворим хитозан; WSC-MP, водоразтворими микрочастици на хитозан; WSC-NP, водоразтворими наночастици на хитозан.

Липиди в серума и черния дроб

Бележки: Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (n = 10); стойностите, маркирани с различните букви в колона, са значително различни (P Таблици 2 и и 3). 3). С изключение на групите WSC-MP и WSC-NP, броят на смъртните случаи за всички тествани дози е по-малък от половината. Следователно, средните стойности на летална доза (LD50) на CTS, WSC, CTS-MP и CTS-NP са> 10 000 mg/kg. Това предполага, че CTS, CTS-MP и CTS-NP не са причинили остра токсичност. Смъртността е 55% за групата на WSC-MP и 65% за групата на WSC-NP. Използвайки таблицата за изчисляване на дозата за определяне на LD50, беше установено, че LD50 за WSC-MP и WSC-NP е съответно 4080 mg/kg и 2370 mg/kg. Според класификацията на острата системна токсичност, базирана на орални LD50 стойности, препоръчани от GB 15193.3-1994 CN, WSC-MP и WSC-NP са определени като клас 4 (501 mg/kg 1000 nm. 30,31 CTS-MP имат голяма повърхност, която може да улесни адсорбцията на липиди и мазнини.

WSC-NP обаче не е доказано по-ефективен при намаляване на наддаването на тегло от WSC-MP. Размерът на частиците на WSC не изглежда да е доминиращият фактор, влияещ върху усвояването на липидите. Това предполага, че механизмът за затлъстяване на WSC може да е различен от този за CTS. Затлъстяването се характеризира на клетъчно ниво чрез увеличаване на броя и размера на адипоцитите, диференцирани от фибробластните преадипоцити в мастните тъкани.32 По време на диференциацията на адипоцитите, транскрипционни фактори, като активиран от пероксизома пролифератор рецептор-γ и CCAAT/енхансер-свързващи протеини, участват в последователната експресия на специфични за адипоцитите протеини, като глюкозен транспортер-4.33 Междувременно, in vitro проучване демонстрира, че CTS олигозахаридите значително намаляват натрупването на липиди.34 Освен това, нивата на експресия на рибонуклеинова киселина в пратеника както на CCAAT/енхансер-свързващи протеини, така и пероксизомният пролифератор-активиран рецептор-γ също е значително намален. Тези резултати предполагат, че WSC-MP може да потисне диференциацията на адипоцитите при физиологични концентрации. Въпреки това, ефектите на WSC-MP върху диференциацията на адипоцитите не са напълно изяснени. По този начин основният механизъм на ефекта на затлъстяването трябва да бъде допълнително изяснен в следващо проучване.

Теглото на мастната тъкан и черния дроб е намалено в групите CTS-MP и WSC-MP, но тези лечения имат малък ефект върху телесното тегло. Чернодробното тегло беше значително намалено само от CTS-MP. Несъответствието на резултатите може да се дължи на различните механизми за намаляване на натрупването на мазнини и телесното тегло. Резултатите от сканиране на геном за затлъстяване предполагат, че няколко преходни потенциални рецепторни канала (TRP) могат да бъдат свързани със затлъстяването.35 В мастната тъкан и преадипоцитите на 3T3-L1 са открити пратеникът рибонуклеинова киселина и протеин на TRPV1, които могат да играят роля в адипогенеза.36 Leung открива, че стимулирането на аферентните нерви на лигавицата на червата от капсаицин води до увеличаване на притока на кръв в червата, което се отслабва от TRP антагонист.37 CTS-MP може да е вид TRP антагонист. Това може частично да обясни защо приемът на CTS-MP намалява натрупването на мазнини в черния дроб, но има малък ефект върху телесното тегло.

С намаляването на размера, нивата на TC и TG на плъховете в групите CTS, WSC, CTS-MP и CTS-NP постепенно намаляват. Това е в съответствие с доклада, че CTS с по-фин размер на частиците е успял ефективно да понижи нивото на плазмените липиди при плъхове.38 Въпреки това, TG е бил повишен в групата на WSC-NP в сравнение с другите групи на лечение. Както бе споменато по-горе, WSC-MP може да потисне диференциацията на адипоцитите при физиологични концентрации. TG се синтезира от глюкоза и мастна киселина, която е включена от глюкозен транспортер-4 и транспортер на мастна киселина CD36 в 3T3-L1 преадипоцити.39 Цитозолният ензим глицерол-3-фосфат дехидрогеназа изглежда има важна роля в превръщането на глицерола в TG.40 WSC-NP може да бъде агонист на глицерол-3-фосфат дехидрогеназа и следователно може да предизвика повишаване на TG. Тази хипотеза изисква допълнителни изследвания.

Заключение

Настоящата работа показва, че CTS и WSC MPs и NP са подходящи за намаляване на наддаването на тегло и имат приемливи оценки за безопасност, които са подходящи свойства за лечение на затлъстяване при хора. WSC-MP и WSC-NP, особено WSC-MP, показаха отличен капацитет за намаляване на наддаването на тегло при затлъстели плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Необходими са обаче in vitro и молекулярни изследвания за допълнително изясняване на механизмите за отслабване. Резултатите от острата токсичност показват, че CTS-MP и CTS-NP са изключително безопасни, а WSC-MP и WSC-NP имат само лек токсичен ефект. Въз основа на тези резултати е очевидно, че CTS и WSC MP и NP са по-добри от обикновените CTS и могат да се използват като потенциални агенти за затлъстяване.

Благодарности

Този проект е подкрепен финансово от Националната фондация за естествени науки на Китай (номер 81173107), Проектът за планиране на науката и технологиите на провинция Гуангдонг, Китай (номер 2010B090400467), Проектът за планиране на науката и технологиите от Zhongshan, Китай (номер 2009H017) и Проектът за планиране на науката и технологиите на Гуанджоу, Китай (номер 11A52130094).