Свързани данни

Резюме

Заден план: Въпреки че ефектите от острите диетични интервенции върху човешкия метаболом са проучени, степента, до която метаболомът може да бъде нормализиран чрез разширена диетична стандартизация, все още не е изследвана.

Обективен: Проучихме метаболитните профили на здрави хора след продължителна диетична стандартизация, за да видим дали присъщите вариации в човешкия метаболом могат да бъдат намалени.

Дизайн: Кохорта от 10 здрави доброволци беше приета в клиничен изследователски център за 2 седмици диетична стандартизация. Ежедневно се събират проби от серум и урина и проби от серум при двуседмично последващо посещение. Пробите са анализирани чрез 1 Н ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) спектроскопия и многовариантни статистически анализи.

Резултати: ЯМР спектрите са събрани за глобално профилиране на метаболитите с по-висока концентрация (> μmol/L концентрации). Наблюдават се метаболитни промени в някои проби от серума след 1-ви ден или последващото посещение за 2 седмици. За всеки субект пробите от всички останали дни имаха подобни профили. Уринарният метаболом не отразява ефекти от диетичната стандартизация. Изследвани са обединени 24-часови проби от урина, което показва, че всяко нормализиране, което се случи, би направило това за 2) е 25,8 (диапазон: 19,9–32,4). 3-та кохорта се състоеше от 55 субекта (23 жени и 32 мъже). Средната възраст на субекта е 31 години (диапазон: 18–58 години), а средният ИТМ е 25,8 (диапазон: 19,1–39,6). Субекти, въздържали се от консумация на алкохол, лекарства, витамини, добавки или билки (с изключение на противозачатъчни хапчета или антидепресанти) за ≥2 седмици преди прием. Допълнителните критерии за изключване включват анамнеза за анормални чернодробни ензими, хронична злоупотреба с алкохол, хронично чернодробно заболяване или анамнеза за употреба на ацетаминофен в продължение на 3 месеца преди скрининга.

Стандартизирана диета

Субектите са получавали постоянна диета с макронутриенти, съставена от обичайни храни за закуска, обяд, вечеря и лека закуска преди лягане, завъртяна на 2-дневен цикъл. Храненето се осигуряваше по постоянно време всеки ден. Хранене, съдържащо 35 калории/кг телесно тегло, се осигурява на базата на действителното телесно тегло на субекта, ако неговият ИТМ е 30. Разграждането на макронутриентите е 15% протеин, 30% мазнини и 55% въглехидрати. Диетите се коригираха, за да се поддържа телесно тегло чрез увеличаване на енергийния прием с 300 калории/ден, ако теглото на пациента намаля с 1 кг, а енергийният прием се намали с 200 калории/ден, ако теглото на пациента се увеличи с 1 кг. Не бяха разрешени други храни; субектите могат да консумират вода, диетична сода без кофеин и черно кафе и чай без кофеин ad libitum.

Предоставените храни и количества за всяка храна са изброени в Допълнителна таблица 1 (вижте под „Допълнителни данни“ в онлайн изданието). Заместването на храната се извършва, ако субектът не може да понася определена храна.

Вземане на проби

Взети са проби от забързана кръв при 0800 дневно и 24-часови проби от урина са събрани и замразени при -80 ° C през цялото проучване. Субектите се върнаха 2 седмици след изписването за последващо посещение и кръвна проба на гладно. (Всички проби от дни 4 и 11 бяха събрани отделно за използване във фармакокинетични анализи и не бяха на разположение за използване с това проучване.)

приготвяне на пробата

Замразените проби от серум и урина се размразяват през нощта при 4 ° С. Аликвотни части от 540 μL серум се добавят към 5-милиметровите NMR епруветки, съдържащи 60 μL разтвор на тежка вода (D2O), който съдържа 26,5 mmol формиат/L за сравнение с химично изместване и 0,2% NaN3 за инхибиране на бактериалния растеж. Аликвотни части от 540 μL урина се добавят към 5 mm NMR епруветки, които съдържат 60 μL 924 mmol фосфатно буфериран D2O разтвор/L при рН 6,14. Разтворът D2O съдържа 4,6 mmol триметилсилилпропионат (TSP) за референтно химично изместване, 92 mmol имидазол за референтно рН и 0,2% NaN3 за инхибиране на бактериалния растеж.

1Н NMR спектроскопия

Всички ЯМР спектроскопски измервания бяха извършени с използване на спектрометър Varian INOVA (Varian Inc, Пало Алто, Калифорния), който работеше при 399.80 MHz (1 Н честота) и при 25 ° C. За събиране на спектрите беше използвана импулсна последователност на Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG). Серумните проби бяха събрани със забавяне на предварителното придобиване от 2,5 s, последвано от 2,0 s пренасищане с разтворител, 90 ° импулс и 100-ms CPMG време на забавяне. Свободните индукционни затихвания бяха получени за 2,56 s с ширина на размах от 4389,8 Hz и 16 384 точки. Проби от урина са събрани със закъснение за рециклиране от 4,1 s, което включва 4,0 s H2O пренасищане. За стесняване на остатъчния пик на водата беше използвано 20-ms време на забавяне CPMG. Широчината на размах от 6388 Hz беше оцифрана с 16 360 точки, което доведе до време за придобиване от 2,56 s. Бяха събрани общо 256 сканирания (т.е. повторения на импулсната последователност) както за проби от серум, така и за урина.

Спектрална обработка

Всички NMR спектри бяха обработени с помощта на ACD/1D NMR Manager 8.0 (Advanced Chemistry Development Inc, Торонто, Канада). Към всеки спектър бяха приложени линейни прогнози за първите 2 точки, 0,3 Hz експоненциално разширяване на линията и нулево пълнене до 32 768 точки. След трансформацията на Фурие, всеки спектър беше ръчно фазиран и беше приложена корекция на базовите линии. Химичните измествания на серумните спектри се отнасят до пика на формиата при 8.47 ppm, а спектрите на урината се отнасят до TSP пика при 0.00 ppm. Областите на спектъра нагоре от 0,00 ppm и надолу от 10,00 ppm бяха отстранени от анализа, тъй като те съдържаха само шум. Областта около пика на остатъчната вода от 4.50 до 5.10 ppm също беше изключена от анализа. След това спектрите на урината и серума бяха обработени като отделни групи.

Спектрите бяха интегрирани чрез използване на метода Intelligent Bucketing в софтуера ACD с размери на контейнерите 0,02–0,06 ppm. За да се намали негативният ефект на шума, контейнерите, съдържащи само шум, бяха изключени. Тези кошчета бяха идентифицирани чрез разглеждане на диапазона от стойности за даден контейнер във всички спектри. Кошовете бяха сортирани чрез увеличаване на диапазона на биновете и беше определен праг, така че контейнерите с обхват по-нисък от прага се считаха за шум.

Многовариатен статистически анализ

NMR данните са импортирани в SimcaP + (версия 11.5; Umetrics, Umeå, Швеция). Данните бяха средно центрирани и мащабирани до дисперсия на Парето (1/√SD). След това беше извършен анализ на основните компоненти (PCA) върху получените данни. Получените двумерни графики на резултатите показват всяка от пробите по оси, които съответстват на основните дисперсионни източници в данните. Чрез използването на този метод подобни проби се групират близо една до друга, докато различните проби са по-отдалечени.

РЕЗУЛТАТИ

Типичните спектри на урината и серума, както и някои назначения на метаболити са показани в Фигура 1 .

продължителната

Примери за 1 H ядрено-магнитен резонансен спектър от урина (A) и серум (B) от здрави доброволци, използвани в това проучване. Показани са значителни метаболитни назначения. Спектрите бяха получени и обработени, както е описано в Предмети и методи. VLDL, липопротеинов холестерол с много ниска плътност; LDL, LDL холестерол; Gly, глицин; Хип, хипурат; Триг, тригонелин, ТМАО, триметиламинов оксид.

Серум

Графиките на резултатите от PCA за серумни данни са показани в Фигура 2А . Първите 2 основни компонента обясняват> 80% от вариацията в данните. В графика на резултатите обектите със сходни спектри и следователно подобни метаболомични профили са разположени близо един до друг. Спектрите от всеки обект обикновено се намират в една и съща област на графиката. Разпределението на проби от всеки субект представлява вътрешно-предметната вариация. Разделянето между предметните групи представлява междупредметната вариация. Както е показано на фигурата, 5 от субектите притежават 1 или 2 точки, които са по-добри от основните им групи. Около основните групи са нарисувани елипси, със стрелка, сочеща към или извън отклонението. Във всички случаи отклоненията са от първия ден или от двуседмичното последващо посещение. Пробите от първия ден бяха придобити след една нощ бързо, както и пробите при последващи посещения. Фактът, че всички останали проби се намират в един и същи регион, предполага, че един ден осигурява цялата възможна нормализация с диетична стандартизация. След първия ден субектите остават в същия общ регион на PCA парцела, който се нарича тяхното метаболитно пространство за времето на клиничното проучване.

Основните компоненти вграждат графики на данните от серумните 1 Н ядрено-магнитни резонансни спектри. Символите обозначават отделни субекти и включват по 12 времеви точки всеки (дни 1–13 плюс 2-седмично проследяване с изключени дни 4 и 11). О: Точки от 5 субекта са затворени с елипса, за да покажат групирането; отклоненията са обозначени със стрелки. Стрелките, насочени към елипсите, съответстват на ден 1, а тези, насочени встрани от елипсите, съответстват на проследяването от 2 седмици. Б: Показани са метаболитни траектории на същите 5 субекта, както в панел А, и е ясно, че освен първия ден или следващия ден, няма последователна посока към точките в хода на изследването. Първият и вторият основни компоненти са отбелязани като t [1] и t [2], съответно.

Във всеки от клъстерите беше проучена траекторията на дните през 2-та седмица за всякакви тенденции. На фигура 2Б, пробите за същите 5 субекта, подчертани на фигура 2А, са свързани през времевия ход. Пробите за всеки от тези субекти бяха изследвани, за да се види дали може да се види постоянна метаболитна траектория за периода от 2 седмици. Беше ясно, че освен първата и последната точки, не се наблюдава тенденция. Може да се очаква, че с разширена диетична стандартизация, метаболомите на всеки от субектите ще станат по-сходни и по този начин ще се насочат към общо местоположение на главния компонент, но това не е така. Точките за всеки субект остават в метаболитното му пространство въз основа на неговия или нейния индивидуален метаботип. Този резултат показва, че разширената диетична стандартизация не трябва да води до объркващ източник на вариации в клиничните проучвания, тъй като метаболомите развиват нова хомеостаза.

За да се изследва биохимичната основа за разделянето на пробите от ден 1 или последващите проби, 2 от 5-те субекта с отклонения са избрани като примери и са моделирани индивидуално. Резултатите за основните компоненти и графиките за принос на 2 теми са показани в Фигура 3 . Във всеки от парцелите с десетки един ден очевидно е отклонение от основната група. Графикът на приноса е подобен на графика за зареждане, но се използва за разкриване на променливите в модела (спектралните контейнери), които са конкретно отговорни за отделянето на отклонението от основната група. Величината на лентата по вертикалната ос показва важността на конкретния спектрален контейнер за разпознаване на отклонението от останалата част от групата, а знакът показва дали този контейнер е по-висок или по-нисък в отклонението. Графикът на приноса на Фигура 3В показва, че този метаболитен профил за ден 1 от този субект е бил по-висок в липидите, лактата и глюкозата в сравнение с следващите дни. Графикът на приноса на фигура 3D показва по-високи концентрации на глюкоза и по-ниски липиди и лактат в метаболомния профил за последващия ден, отколкото за следващите дни.

Резултати за основните компоненти и приноси на участници от 2 теми, които показват един ден, който ясно се различава от останалите. О: Графиката на резултатите по тази тема е отбелязана с дните на всяка проба и е ясно, че ден 1 е отклонение от групата. Б: Графикът на приносите показва, че това се дължи до голяма степен на повишената глюкоза и липидите в пробата за ден 1. В: Графиката на резултатите от тази тема показва, че последващият (FU) ден е бил очевидно различен. D: Графикът на приноса показва, че тази разлика, показана в панел C, се дължи на намаляване на липидите и повишаване на глюкозата. Абсцисата на графика на приноса е съставена от спектралните контейнери, използвани в модела за анализ на основните компоненти. Първият и вторият основни компоненти за всеки от графиките на резултатите са отбелязани като t [1] и t [2], съответно.

Урина

Резултатите от графика на PCA от данните за урината са показани в Фигура 4А . Тъй като всички проби от урина са обединени 24-часови колекции и този тип събиране не е възможно за проследяване 2-седмично, проби от урина от проследяване 2-седмично не са използвани. Като цяло резултатите от сюжетите показват по-широко разпределение на извадките, което показва по-висока степен на междупредметна вариация. Точките от 5 обекта са затворени от елипси на фигура 4А. Точките от същите тези 5 субекта са свързани на Фигура 4В, за да покажат, че няма последователна траектория в течение на двуседмичния период.

Основните компоненти изброяват графики на данните от 1 H ядрено-магнитен резонансен спектър. Символите означават отделни субекти и включват 11 времеви точки (дни 1–13, с изключение на дни 4 и 11; не са събрани 2-седмични последващи проби). О: Точки от 5 обекта са затворени с елипса, за да се покажат групировките. Б: Показани са метаболитни траектории на същите 5 субекта, за да се изясни, че не се случва нормализиране по време на двуседмичния ход. Първият и вторият основни компоненти са отбелязани като t [1] и t [2], съответно.

Тъй като предишните данни показват, че всяка стандартизация на метаболомите поради контролирана диета се случва в рамките на 1 d, бяха изследвани проби от урина от 55 субекта само с 3 d диетична стандартизация. За тази част от изследването не са налични серумни проби за всички субекти. Смяташе се, че чрез увеличаване на броя на пробите може да се открият по-фините промени в метаболома и по този начин ще бъдат разкрити някои нормализиращи ефекти от 3-те дни на диетичната стандартизация. Графиките на резултатите от PCA за тези данни са показани в Фигура 5 . Ясно е, че няма значително разделяне на пробите от дни 1, 2 или 3. Изграден е контролиран модел на частични най-малки квадрати за тези данни (данните не са показани) и резултатите потвърждават, че няма статистически валидно разделяне от дните.

Основните компоненти оценяват графика на данните за урината за 55 субекта в дни 1–3 от изследването. В този сюжет дните са представени с различни символи. Липсата на сегрегация на проби от всеки от 3 d показва, че не може да се открие нормализиране с тази по-голяма кохорта. Първият и вторият основни компоненти са отбелязани като t [1] и t [2], съответно.

ДИСКУСИЯ

Това проучване е предназначено да отговори на въпроса колко нормализиране може да бъде постигнато в човешкия метаболом чрез внимателен контрол на диетата и околната среда. Други проучвания разглеждат ефектите от острата стандартизация на диетата при здрави хора. През 2006 г. Walsh et al (16) изследваха урина, плазма и слюнка от 30 здрави човешки индивида в продължение на 4 отделни дни в продължение на 1 месец. Те откриха, че метаболомите на серума и слюнката не са засегнати от диетичния контрол, но е отбелязано намаляване на междупредметните вариации в профилите на урината след стандартизирана диета в деня преди последното посещение.

В друго проучване на Lenz et al (14), 12 здрави мъже са изследвани на 2 отделни дни, на 14 d разстояние. Това проучване установи по-голямо разнообразие в спектрите на първите празнини в урината в сравнение с тези на пробите от 0-12 до 12 и 24 часа. Те стигнаха до заключението, че първите празни урини са най-променливите и най-вероятно се влияят от неконтролираната диета и активността на участниците преди проучването.

По отношение на серумния метаболом, гореспоменатите проучвания стигнаха до заключението, че диетичната стандартизация в деня преди или в деня на вземането на проби не доведе до наблюдавано нормализиране. Чрез удължаване на диетичната интервенция, нашите резултати показват, че за почти половината от субектите, метаболитната траектория от ден 1 показва, че се постига известно нормализиране на метаболома с един ден на стандартизирана диета. Изследването на извънредните стойности показа, че след еднонощно гладуване концентрациите на глюкоза и някои липиди се различават от тези, постигнати след 24 часа при стандартизираната диета. Контролираната с калории, стандартизирана диета изглежда е създала нова хомеостаза за липиди и глюкоза след 24 часа при 5-те субекта, които са имали по-големи проби. Има две възможни причини, поради които този ефект се наблюдава в нашето проучване, а не другите 2 проучвания: 1) чрез разширяване на диетичната стандартизация, ние получаваме по-ясна картина на метаболитното пространство на всеки човек и следователно по-различните дни са по-различни; и 2) по-строгият хранителен и екологичен контрол, осигурен от стационарно проучване, може да позволи наблюдението на по-фини ефекти.

В работата на Walsh et al (14) и Lenz et al (16) се забелязва нормализиране на метаболома в урината след остра диетична стандартизация. В нашето проучване не се наблюдава стандартизация, но това не оспорва констатациите на Walsh et al и Lenz et al (14, 16). Събрахме обединени 24-часови проби от урина, докато групите Уолш и Ленц анализираха много по-променливите проби от сутрешни и вечерни колекции за първи път. Разумно е острите диетични ефекти да са по-отчетливи при тези проби, фокусирани върху времето. По същество тези ефекти буквално се разреждат от нашите 24-часови колекции. Фактът, че разширената диетична стандартизация не показа допълнителен нормализиращ ефект върху метаболома в урината, показва, че както при серума, нормализиращият ефект на диетата е завършен след 24 часа.

Доколкото ни е известно, това проучване осигурява най-високата степен на хранителен и екологичен контрол в изпитване за човешка метаболомика до момента. Това проучване е проведено чрез използване на глобално ЯМР-профилиране и поради това трябва да се имат предвид присъщите ограничения на чувствителността на ЯМР. Компонентите на метаболома, които са под микромоларни концентрации, няма да бъдат открити от аналитичната платформа, използвана в това проучване. Възможно е компонентите с ниска концентрация (напр. Фитохимикали или витамини) да бъдат открити чрез използване на по-чувствителен метод като целенасочена течна хроматография – мас спектрометрия. В бъдещи изследвания на метаболомиката изглежда, че стандартизирана диета, която продължава един ден, може да е достатъчна, за да осигури цялата нормализация, която може да бъде постигната в човешкия метаболом.

Допълнителен материал

Благодарности

Отговорностите на авторите бяха следните - JHW: проведе метаболомични експерименти и многовариантни статистически анализи; MGB: допринася за дизайна на клиничното проучване и подпомага интерпретацията на резултатите; PBW: проектира клиничното изпитване; и TMO: замисля и проектира експериментите по метаболомика, ръководи интерпретацията на данните и е автор на ръкописа. Нито един от авторите не е имал конфликт на интереси.