Резюме

Цели

Стресът от ендоплазмен ретикулум (ER) причинява дисфункция на мастната тъкан и хронично възпаление при затлъстяване. Съобщава се, че пчелното млечице (RJ) и богатата на токотриенол фракция (TRF) подобряват възпалението. Въпреки това подобряващите ефекти на RJ и TRF върху възпалението от гледна точка на модулиращия стрес ER не са оценени досега. Следователно, ние изследвахме ефекта на RJ и TRF върху ER стрес и някои възпалителни маркери, получени от мастна тъкан, при затлъстяване, индуцирано от високо съдържание на мазнини (HFD). Плъхове с дебелина Wistar, разпределени на случаен принцип в 5 групи: HFD, диета за ограничаване на калориите (CRD), RJ + CRD, TRF + CRD, RJ + TRF + CRD. След 8-седмична интервенция мастните тъкани и хипоталамуса се дисектират и серумът се събира.

Резултати

RJ намалява експресията на регулиран глюкоза протеин-78 (GRP78) като индикатор за ER стрес в WAT и хипоталамуса в сравнение с CRD. Освен това RJ намалява експресията на възпалителни маркери в бялата мастна тъкан (WAT) и също така намалява серумната концентрация на тях. TRF намалява възпалителните маркери в серума без забележителни ефекти върху ER стрес. Като цяло, RJ има защитен ефект срещу дисфункция на мастната тъкан и възпаление, след което се предлага като терапевтичен подход за намаляване на някои усложнения, свързани със затлъстяването. Въздействието на TRF в това отношение е по-ниско от RJ и е ограничено до системно подобрение на възпалението без забележителни промени в възпалението на мастната тъкан.

Въведение

Затлъстяването е една от основните причини за хронични заболявания в световен мащаб и връзката му с възпалението е добре установена [1]. Бялата мастна тъкан (WAT) регулира метаболизма в тялото чрез освобождаване на няколко хормона и цитокини [2, 3]. Високо количество секреция на възпалителни цитокини от разширена WAT и диспропорция в провъзпалителни и противовъзпалителни биомаркери като фактор на туморна некроза-алфа (TNF-α), моноцитен хемоаттрактант протеин 1 (MCP1), интерлевкин-6 (IL-6) срещу интерлевкин-10 (IL-10), адипонектин допринасят за усложнения, свързани със затлъстяването [4, 5].

Няколко нарушения, предизвикани от затлъстяването, се етиологично приписват на хронично възпаление във връзка със затлъстяването [6, 7]. Все повече доказателства сочат към друго възпалително състояние, наречено стрес на ендоплазмен ретикулум (ER), което е състояние, което се случва при хранителен излишък при затлъстяване и метаболитна дисфункция [8, 9]. Събраните проучвания съобщават за забележимо активиране на ER стрес чрез затлъстяване, индуцирано от високо съдържание на мазнини (HFD) [8, 10]. Също така, все повече доказателства демонстрират взаимодействието между ER стрес и патологията на затлъстяването [11,12,13]. ER е жизненоважна вътреклетъчна органела, която организира синтеза, сгъването и зареждането на протеините [14]. Несъответствието между тази функция поради състояния на клетъчен стрес, причинява разгънат протеинов отговор (UPR) и ER стрес [14, 15]. Регулираният от глюкозата протеин-78 (GRP78) поради ролята си в сгъването на протеини се счита за ключов регулатор на ER стреса [9]. ER стресът в мастната тъкан намалява термогенезата и играе важна роля в дисфункцията на мастната тъкан, променя секрецията на цитокини и причинява хронично възпаление в адипоцитите [3, 14]. Освен това подобряването на хипоталамусния ER стрес предизвиква покафеняване на WAT, което от своя страна намалява секрецията на възпалителни фактори от адипоцитите и накрая подобрява нарушенията, свързани със затлъстяването [11].

В днешно време по отношение на последиците от възпалението съществува потенциален интерес да се обърне предизвиканият от затлъстяването ER стрес и възпаление. В тази връзка Gregor et al. показа, че загубата на тегло намалява ER стреса и GRP78 при затлъстяване [9]. Освен това все повече доказателства се фокусират върху функционални храни с противовъзпалителни свойства [15, 16].

Пчелното млечице (RJ) е важен продукт от медоносните пчели с антиоксидантни и противовъзпалителни свойства [17,18,19]. Освен това се предлагат противовъзпалителни дейности за токотриенолите (Т3), важна част от семейството на витамин Е [20,21,22]. Kim et al. проучване демонстрира ефекта на Т3 върху възпалението на черния дроб чрез модулиране на ER стрес [16]. Доколкото ни е известно, потенциалните инхибиторни въздействия на RJ и T3 върху ER стреса в хипоталамуса като регулаторна тъкан и мастните тъкани, като важни места, балансиращи секрецията на цитокини, все още не са оценени. Съответно, това проучване има за цел да изследва ефекта на RJ и T3 чрез диета за ограничаване на калориите (CRD) върху WAT, кафява мастна тъкан (BAT) и хипоталамусен ER стрес и някои възпалителни маркери при HFD-индуцирано затлъстяване при модел на плъх.

Основен текст

Материали и методи

Животни и експериментален дизайн

Петдесет и пет мъжки плъха Wistar са закупени от Института Пастьор (Техеран, Иран) на възраст 4 седмици и тегло 55 ± 4 g, след което животните са държани индивидуално в клетки, след което се аклиматизират при контролирани условия (стаи с 21–24 ° C, 50–60% относителна влажност и 12/12 h обратен цикъл светлина-тъмнина) за 1 седмица. Всички процедури за боравене и използване на животни са одобрени от Комитета по етика на Иранския университет по медицински науки и са базирани на ръководството на Националните институти по здравеопазване за грижа и използване на лабораторни животни [23].

Първо, плъховете бяха поставени на случаен принцип върху ad libitum HFD групата (n = 50), включваща 60% kcal от групата с мазнини и нормална диета (ND), която хранеше стандартна лабораторна чау диета (n = 5) в продължение на 17 седмици. Животните се претеглят всяка седмица. Когато средното тегло на плъхове, хранени с HFD, става значително повече от плъховете в групата с ND и индуцираният модел на затлъстяване, плъховете са разделени на случаен принцип в една от следните пет групи за допълнителни 8 седмици (n = 10/група): I. RJ хранени по време на CRD II. TRF, подаван по време на CRD III. RJ + TRF, подадени по време на CRD IV. CRD без добавка и V. HFD без добавка (останете на HFD). Размерът на пробата, определен съгласно предишни подобни проучвания [24].

Съставът на CRD е подобен на HFD с 30% ограничение на калориите (Приложение 1). RJ групата се третира със 100 mg/kg лиофилизиран RJ прах, съдържащ 6% транс-10-хидрокси-2-деценова киселина, а TRF групата се третира с 85 mg/kg TRF. TRF се състои от 11,9% (w/w) α-токоферол, 12% α-токотриенол, 2% β-токотриенол, 19,3% y-токотриенол, 5,5% δ-токотриенол и 23,5% α-токоферол. Администрираните дози RJ и TRF са избрани, като се вземат предвид предходни проучвания, базирани на не наблюдавани неблагоприятни ефекти [25, 26].

И накрая, животните бяха подложени на 12 часа на гладно и анестезирани с инжекция на ксилазин (ксилазин 2%, 20 mg ml -1, Alfasan, Холандия) и кетамин (кетамин 10%, 100 mg ml -1, Alfasan, Холандия) интраперитонеално, след това кръв се събира чрез сърдечна пункция. Кръвните проби се центрофугират при 2500 хж за 15 минути и серумни проби бяха замразени при - 80 ° C. Ингвиналният WAT, интерскапуларният BAT и хипоталамусът бяха отстранени, промити с буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) и замразени при -80 ° C в разтвор за стабилизиране на РНК по-късно до анализ на генната експресия.

Биохимичен анализ

Концентрациите на TNF-α и MCP-1 в серума са измерени с помощта на комплект за имуноанализ на TNF-α и MCP-1 (MyBioSource, Inc., Сан Диего, САЩ) съгласно протоколите на производителя.

Изолация на РНК и количествена PCR в реално време

Общата РНК на WAT, BAT и хипоталамуса се екстрахира с Trizol Reagent. Синтезираната комплементарна ДНК (cDNA) чрез обратна транскрипция се усилва чрез PCR в реално време на количествена PCR система. PCR амплификацията беше проведена с флуоресцентна термична циклична система, използвайки SYBR зелен комплект и специфични за плъхове последователности от праймери за GRP78, TNF-α и MCP-1 като целеви гени и β-актин като домакински ген. Всички споменати експерименти са извършени с експерти, които са били заслепени за групи за лечение.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средна стойност ± SEM. t тест и еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc тест на Tukey, извършен за сравняване на разликата между две и повече от две групи съответно. P-стойност

Резултати

Не пропуснахме нито едно животно и беше направен анализ на всички включени плъхове. Затлъстелите животни след CRD забележително намалено тегло спрямо HFD. Когато плъхове, хранени с CRD, лекувани с RJ и RJ + TRF, се наблюдава значително по-голяма загуба на тегло в сравнение с CRD само. TRF не може да намали повече тегло от CRD (Таблица 1).

Оценихме ER стреса при WAT, BAT и хипоталамуса чрез измерване на експресията на GRP78 след CRD самостоятелно и заедно с RJ и TRF. CRD намалява ER стреса в хипоталамуса, WAT и BAT, но промените в нивата на иРНК на GRP78 не достигат значителни нива (Фиг. 1а). Когато RJ беше добавен към CRD, нивото на иРНК на GRP78 в WAT и хипоталамуса, но не и в BAT, значително намаля в групите RJ и RJ + TRF спрямо групата CRD. TRF обаче не може да намали GRP78 при значителни нива в оценената тъкан в сравнение с групата CRD (фиг. 1б).

пчелно

Освен това оценихме възпалението при WAT и BAT чрез измерване на експресията на TNF-α, MCP1 и тяхната серумна концентрация. Експресията на TNF-a и MCP1 е намалена в WAT на CRD-хранени плъхове спрямо HFD групата (Фиг. 2а, b). Концентрацията им в серума също значително намалява след CRD (Таблица 1). Както е показано на фиг. 2в и г, след добавяне с RJ и RJ + TRF, нивото на иРНК на TNF-α и MCP1 в WAT намалява забележително в сравнение с CRD, но TRF не. Промените в експресията на TNF-α и MCP1 при НДНТ нито в RJ, нито в TRF групите достигат значителни нива. Освен това серумните концентрации на TNF-α и MCP1 намаляват значително след лечение с RJ, RJ + TRF и TRF (Таблица 1).

Дискусия

Възникващите данни показват, че няколко нарушения, свързани със затлъстяването, етиологично са резултат от дисбалансирани възпалителни маркери [6, 7]. Освен това, наличните доказателства демонстрират ролята на хипоталамусния ER стрес в патогенезата на HFD-индуцирано затлъстяване при животинския модел. Установено е, че хипоталамусният ER стрес причинява дисфункция на мастната тъкан и съответно по-голяма секреция на възпалителни цитокини [11, 27].

TRF, нито в мастната тъкан, нито в хипоталамуса, значително намалява нивата на иРНК на GRP78 повече, отколкото CRD при плъхове със затлъстяване. Консумацията на TRF обаче намалява TNF- и MCP-1 в серума повече от CRD, но не и в мастните тъкани. Впоследствие TRF може да облекчи някои усложнения, свързани със затлъстяването, като съдови проблеми. В неотдавнашно проучване системното намаляване на възпалението е независимо от намаляването на стреса на ER в ингвиналната WAT и хипоталамуса. Нашата констатация показва възпаление, намалено в ингвиналната WAT на TRF, хранено с плъхове, но не достига значителни нива. Може би TRF е причинил повече намаляване на възпалението във висцералната WAT и други тъкани. Нашите резултати са в съответствие с предишни доклади за противовъзпалителния ефект на TRF, но не потвърждават някои предишни проучвания за инхибиторния ефект на γT3 върху ER стрес [16, 29]. Тези проучвания оценяват ефекта на чист γT3 върху чернодробния ER стрес, който вероятно оказва по-силни ефекти от TRF. Инхибиторните ефекти на α-токоферола срещу Т3 и тяхното възможно взаимодействие не могат да бъдат пренебрегнати [30].

Contreras и сътр. показа, че потискането на ER стреса в хипоталамуса задейства WAT ремоделиране и активиране на BAT чрез индуциране на симпатиковата нервна система (SNS) [11]. Освен това наскоро разкрихме, че RJ администрацията активира BAT и също така причинява WAT ремоделиране чрез симпатикова активация [31]. Следователно ние предполагаме, че RJ играе критична роля в модулацията на хипоталамусния ER стрес и води до активиране на SNS, което от своя страна активира WAT покафеняване и намалява ER стреса в WAT и отслабва предизвиканото от затлъстяването възпаление.

Групата RJ + TRF демонстрира противовъзпалителни ефекти, подобни на плъхове, хранени с RJ. по отношение на незначителния ефект на TRF при потискане на стреса на ER, следователно е вероятно RJ да е отговорен за модулацията на ER стреса в групата RJ + TRF.

Като цяло, настоящото проучване предполага, че RJ заедно с CRD предпазват от HFD-индуциран ER стрес в хипоталамуса и WAT. Предполагаме, че ER модулацията на стреса изглежда е възможен механизъм, чрез който RJ упражнява някои от своите противовъзпалителни свойства, след което подобрява дисфункцията на мастната тъкан и възпалителното състояние при затлъстяване повече от CRD самостоятелно. Следователно, RJ може да се разглежда като терапевтичен подход за намаляване на някои заболявания, свързани със затлъстяването.

Ограничение

Най-важното предимство на неотдавнашното разследване беше, че това проучване беше първото, което оценява ефекта на ER модулаторните ефекти на RJ и TRF в модела на затлъстяването. Основното ограничение на това проучване беше, че не използваме генетично модифицирани плъхове. Следователно нашите констатации трябва да бъдат потвърдени с повече проучвания в това отношение с нокаут модели за оценка на ролята на ER стрес и GRP78 в бъдеще.

Наличност на данни и материали

Наборите от данни, използвани в настоящото проучване, се предоставят от съответния автор при разумна заявка.