Катедра по хербология, Колеж по корейска медицина, Университет Тегу Хаани, Тегу, Корея.

Катедра по хербология, Колеж по корейска медицина, Университет Тегу Хаани, Тегу, Корея.

Катедра по хербология, Колеж по корейска медицина, Университет Тегу Хаани, Тегу, Корея.

Адресна кореспонденция на: д-р Jeong Sook Noh, Департамент по хранителни науки и хранене, Университет Tongmyong, 428, Sinseon-ro, Nam-gu, Busan 48520, Република Корея,

Департамент по хранителни науки и хранене, Университет Tongmyong, Пусан, Корея.

Д-р Seong-Soo Roh, катедра по хербология, Колеж по корейска медицина, Университет Daegu Haany, Daegu 42158, Република Корея,

Катедра по хербология, Колеж по корейска медицина, Университет Тегу Хаани, Тегу, Корея.

Резюме

Въведение

Необходими са нови терапевтични подходи за затлъстяване поради нарастващото му разпространение в световен мащаб. Затлъстяването се характеризира с повишена маса на бялата мастна тъкан (WAT), която е резултат от увеличеното натрупване на мазнини. 1 Повишената мастна маса е свързана с повишени нива на възпалителни молекули и секреция на високи нива на адипокини, които са свързани с метаболитни дисфункции като инсулинова резистентност, хипергликемия и хиперлипидемия. 2–4 Това необичайно натрупване на WAT причинява редица заболявания като метаболитен синдром, сърдечно-съдови заболявания и някои форми на рак. 5,6 Следователно отслабването на телесната мастна маса може да намали честотата и развитието на метаболитни заболявания. 7

Адипогенезата и натрупването на триглицериди в адипоцитите допринасят главно за разширяването на мастната тъкан. 8 Адипогенезата е процес на диференциация на адипоцитите, който се регулира от много транскрипционни фактори като активиран от пероксизома пролифератор гама рецептор (PPARγ), CCAAT енхансер-свързващ протеин алфа (C/EBPα) и протеини, свързващи елементите, регулиращи стерола (SREBP). 9,10 Активирането на тези ядрени фактори увеличава експресията на техните протеини надолу по веригата, като ензими, свързани с метаболизма на мастните киселини и холестерола. 11–13 Механизмите, свързани с липидния метаболизъм в мастната тъкан, са предложени като цели за профилактика на затлъстяването, включително потискане de novo липогенеза и засилване на окисляването на мастните киселини. 14 Следователно регулирането на диференциацията на адипоцитите и метаболизма на липидите (синтез на триглицериди и холестерол) в WAT може да бъде ключов регулаторен фактор за профилактика или лечение на затлъстяването.

Материали и методи

Материали

Комплектът за анализ на протеин за бицинхонинова киселина е получен от Thermo Fisher Scientific (Рокфорд, Илинойс, САЩ). Заешки поликлонални антитела срещу PPARα, PPARγ, SREBP-1, SREBP-2, β-хидрокси-метилглутарил коензим А редуктаза (HMGCR), C/EBPα, чернодробен X рецептор (LXR) α/β, миши моноклонални антитела срещу β-актин и хистони и козе поликлонално антитяло срещу стеароил-КоА десатураза-1 (SCD-1) са закупени от Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта Круз, Калифорния, САЩ). Заешки поликлонални антитела срещу ацетил-CoA карбоксилаза (ACC) и фосфо-ацетил-CoA карбоксилаза (p-ACC) са закупени от Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Моноклонално антитяло на мишка срещу ATP-свързващ касетен транспортер А1 (ABCA1) е закупено от Abcam (Cambridge, MA, USA). ECL реагентите за откриване на уестърн блотинг са получени от GE Healthcare (Piscataway, NJ, САЩ).

Приготвяне на воден екстракт от YPF

YPF е добит в Gyeongsangbuk-do Agricultural Research & Extension Services (Gyeongsangbuk-do, Корея) и е нарязан на малки парчета и лиофилизиран (Freeze Dryer 8508; Ilshinbiobase Co., Gyeonggi-do, Корея). YPF имаше изцяло зеленикав цвят точно преди началото на пигментацията; младите хурми бяха с диаметър 8–10 cm и тегло 60 - 80 g. Изсушеният материал се смила на прах с помощта на електрически хомогенизатор (Rong Tsong Precision Technology Co., Тайпе, Тайван). Смленият плод (100 g) се екстрахира чрез разреждане 10 пъти с дестилирана вода, последвано от кипене в продължение на 1 час и след това се филтрува, изпарява се при 45 ° С и се суши чрез замразяване. Добивът на YPF воден екстракт (YPFE) е 11,3% ± 0,8% и YPFE се съхранява при -80 ° C.

Експериментални животни и лечение

Измерване на съдържанието на липиди в серума и WAT

Серумните нива на триглицеридите и общите нива на холестерола се измерват с помощта на тестови комплекти (Asan Pharm. Co., Ltd, Сеул, Корея). WAT се хомогенизира в студен 0.9% (v/v) NaCl буфер. Хомогенатът се екстрахира със смес от хлороформ и метанол (2: 1, v/v) съгласно метода, разработен от Folch и др., 28 и сместа се центрофугира при 1670 ж за 15 минути. Органичният слой се събира и изсушава и остатъкът се разтваря в изопропанол. Съдържанието на триглицериди и общ холестерол бяха определени с помощта на комплекти (Asan Pharm. Co., Ltd.).

WAT маслено червено O оцветяване и измерване на размера на адипоцитите

Замразеното WAT беше нарязано на 7 μm секции и монтирани на микроскопични предметни стъкла Probe-On-Plus (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) за оцветяване с маслено червено. Срезите се третират с масленочервен О разтвор за 7 минути при 60 ° С и след това се инкубират с 85% (обем/обем) пропилей гликол за 3 минути. След изплакване с вода срезовете бяха оцветени с хематоксилин на Харис. Тъканите се наблюдават под светлинен микроскоп (Nikon ECLIPSE Ti; Nikon Co., Токио, Япония) и размерът на адипоцитите се измерва с помощта на софтуерната програма i-Solution Lite (Innerview Co., Сеул, Корея).

Подготовка на постнуклеарни и ядрени фракции

Ядрените протеини бяха извлечени съгласно метода на Komatsu. 29 Накратко, WAT беше хомогенизиран с ледено-студен лизисен буфер, съдържащ 5 mM Tris-HCl (рН 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M захароза, 0.1 M DTT и протеазна инхибиторна смес. След центрофугиране (10 500 ж в продължение на 20 минути при 4 ° С), супернатантната фракция се използва като постнуклеарна фракция и гранулата се суспендира в буфер за ядрена екстракция, съдържащ 20 тМ 2- [4- (2-хидроксиетил) -1-пиперазил] етан сулфонова киселина (рН 7.9), 1.5 mM MgCl2, 0.42 M NaCl, 0.2 mM EDTA, 25% (v/v) глицерол, 0.1 M DTT, и смес от протеазни инхибитори. Ядрената фракция се възстановява чрез центрофугиране при 20 500 ж за 5 минути при 4 ° С. Концентрацията на протеин във всяка фракция се определя с помощта на комплект за анализ на протеин на бицинхонинова киселина.

Western blot анализ

Постнуклеарни и ядрени фракции (1 μg протеин /μL, съответно) се подлагат на 8–13% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза. Отделените протеини се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана, блокират се с 5% (v/v) обезмаслен млечен разтвор за 1 h и се инкубират с първични и вторични антитела за 1,5 h при стайна температура. Всеки комплекс антиген-антитяло се визуализира с помощта на ECL реагенти за откриване на уестърн блотинг и се открива чрез хемилуминесценция със SENSI-Q2000 Chemodic (Lugen Sci. Co., Ltd, Сеул, Корея). Лентовите плътности бяха определени с помощта на ATTO Densitograph Software (ATTO Corp., Токио, Япония) и количествено определени като съотношение на β-актин или хистони.

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка. Статистическите сравнения бяха оценени чрез еднопосочен ANOVA (дисперсионен анализ), последван от Dunnett post hoc тестове с помощта на софтуера SPSS 13.0 за Windows (SPSS, Inc., Чикаго, IL, САЩ). Съществени разлики бяха разгледани при P

Таблица 1. Телесно тегло, тегло на мастната тъкан и прием на храна при затлъстяване db/db Мишки, администрирани с екстракт от млад плод на хурма в продължение на 3 седмици

Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE, н = 7. Значимост: * P ** P *** P

Таблица 2. Биохимични анализи на затлъстяване db/db Мишки, администрирани с екстракт от млад плод на хурма в продължение на 3 седмици

Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE, н = 7. Значимост: * P ** P *** P

екстрактът

Фиг. 1. Маслено червено O оцветяване на мастната тъкан със затлъстяване db/db мишки, прилагани с YPFE в продължение на 3 седмици. (А) Nonobese мъгливи мишки, (Б) лекувани с превозно средство затлъстяване db/db мишки, (° С) 100 mg/kg телесно тегло, лекувано с YPFE затлъстяване db/db мишки, (Д) 200 mg/kg телесно тегло, лекувано с YPFE затлъстяване db/db мишки. Оригинално увеличение 200 ×. YPFE, екстракт от млада хурма.

YPFE намалява протеиновата експресия на свързаните с адипогенезата транскрипционни фактори в WAT

Както е показано на Фигура 2, изразът на PPARγ, което е свързано с диференциация на адипоцитите, е значително увеличено в групата Veh с 57% в сравнение с м/м група (P

Фиг. 2. PPARγ, C/EBPα, и експресия на LXR протеин в мастната тъкан на затлъстяването db/db мишки, прилагани с YPFE в продължение на 3 седмици. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE, н = 7. m/m, нонобез мъгливи мишки; Автомобил, лекуван с превозно средство затлъстяване db/db мишки; Y100, лекувано с YPFE затлъстяване db/db мишки (100 mg/kg телесно тегло); Y200, лекувано с YPFE затлъстяване db/db мишки (200 mg/kg телесно тегло). Значение: *P

YPFE инхибира синтеза на триглицериди и повишеното окисление на мастните киселини в WAT

Фигура 3 показва ефекта на YPFE върху експресията на SREBP-1, PPARα, и SCD-1 в WAT на затлъстели мишки. В групата Veh, SREBP-1 е увеличен с 60,8% в сравнение с м/м група; експресията му обаче е значително намалена с 31,6% в групата Y200 в сравнение с групата Veh (P

Фиг. 3. SREBP-1, PPARα, Експресия на ACC и SCD-1 в мастната тъкан на затлъстяването db/db мишки, прилагани с YPFE в продължение на 3 седмици. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE, н = 7. Значимост: *P

YPFE регулира експресията на протеин, свързана с метаболизма на холестерола в WAT

Експресията на SREBP-2 беше увеличена в групата Veh в сравнение с м/м група (P

Фиг. 4. Експресия на SBEBP-2, HMGCR и ABCA1 протеин в мастната тъкан на затлъстяването db/db мишки, прилагани с YPFE в продължение на 3 седмици. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE, н = 7. Значимост: *P

Дискусия

Затлъстяването се причинява от повишено натрупване на мазнини поради адипогенеза и хипертрофия на адипоцитите в мастната тъкан. 30 В настоящото проучване, за да идентифицираме ефекта на затлъстяване на YPF, използвахме дефицит на лептинов рецептор db/db мишки като животински модели на затлъстяване, показващи характеристиките на неограничен прием на храна и прекомерно натрупване на телесни мазнини. 31 В началото на експеримента, db/db мишките вече бяха затлъстели. Приложението на YPFE ефективно намалява крайното телесно тегло и демонстрира тенденция към намаляване на теглото на мастната тъкан без никаква разлика в приема на храна между затлъстелите групи. Нещо повече, съдържанието на триглицериди и общия холестерол в серума и WAT бяха значително намалени от приложението на YPFE. В предишно проучване YPF ефективно подобрява дислипидемията при модел на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, като увеличава отделянето на фекални жлъчни киселини и ефектът му е по-голям в сравнение със зрялата хурма. 21,27 Тези резултати са в съответствие с нашето проучване, което предполага, че може да се очаква намаляване на телесното и WAT тегло чрез намаляване на съдържанието на липиди в кръвта и WAT.

Фиг. 5. Възможен механизъм на хиполипидемичния ефект на YPF върху мастната тъкан на затлъстели мишки. Мастната тъкан на затлъстяването db/db мишки показаха нарушена регулация на адипогенезата, синтеза на триглицериди, FAO, синтеза на холестерол и свързаната с ефлукс експресия на протеин. The стрелки посочете ефекта от приложението на YPFE върху всеки път (твърдо, значителен ефект; пунктирана, лек ефект, но не значителен). Прилагането на YPFE подобрява затлъстяването чрез регулиране на всеки път в мастната тъкан. FAO, окисляване на мастни киселини.

В заключение, прилагането на YPFE на затлъстели мишки подобри липидния метаболизъм в WAT чрез регулиране на експресията на PPAR и SREBP транскрипционни фактори, което предполага, че YPF може да служи като потенциална терапия срещу затлъстяване за регулиране на физиологията на адипоцитите в мастната тъкан.

Изявление за разкриване на автор

Всички автори нямат конфликт на интереси, финансов или друг.

Информация за финансиране

Авторите не са получили конкретно финансиране за тази работа.