Диана П. Божанова

1 Катедра по биологични науки, Университет Вандербилт, Нашвил, Тенеси, Съединени американски щати

Сет Р. Борденщайн

1 Катедра по биологични науки, Университет Вандербилт, Нашвил, Тенеси, Съединени американски щати

2 Катедра по патология, микробиология и имунология, Университет Вандербилт, Нешвил, Тенеси, Съединени американски щати

Резюме

Фекалните трансплантации се използват все по-често за лечение на повтарящи се инфекции (т.е. Clostridium difficile) в човешките черва и като общ изследователски инструмент за експерименти с повишаване на функцията (т.е. измерване на фекални пелети) при животински модели. Промените, наблюдавани в биологията на реципиента, обикновено се приписват на бактериални клетки в изпражненията на донора (

10 11 на грам човешко мокро изпражнение). Тук изследваме литературата и обобщаваме констатациите за състава на фекалните вещества, за да повишим внимателно профила на неговата многодетна природа. В допълнение към жизнеспособните бактерии, които могат да съставят малка част от общата фекална маса, други компоненти в непреработените човешки изпражнения включват колоноцити (

10 7 на грам мокро изпражнение), археи (

10 8 на грам мокро изпражнение), вируси (

10 8 на грам мокро изпражнение), гъбички (

10 6 на грам мокро изпражнение), протести и метаболити. По този начин, макар да е спекулативен в този момент и зависи от процедурата по трансплантация и системата за изследване, небактериалната материя може да допринесе за промени в биологията на реципиента. Има предпазлива нужда от продължителен редукционизъм, за да се отделят ефектите и взаимодействията на всеки компонент.

Въведение

Фекалната трансплантация - прехвърлянето на изпражнения или части от изпражненията от един организъм в стомашно-чревния тракт на друг - бързо привлича вниманието като лечение на човешки чревни инфекции и като инструмент за функционални "пробивни" изследвания на микробиотата при животни модели. При хората процедурата се нарича трансплантация на фекална микробиота, тъй като микробните компоненти обикновено са обогатени, а при животински модели прехвърлянето на необработен стол обикновено се постига чрез хранене или орално изследване на фекални вещества. За целите на това есе ще използваме общата фраза на „фекални трансплантации“, за да се позовем на всички видове процедури. Фигура 1 показва съвсем скорошния растеж на термина в референции PubMed, включващ проучвания както на хора, така и на моделни системи.

трансплантации

Графиките показват (A) бързото нарастване на публикациите за фекални трансплантации в услугата за търсене на Националната медицинска библиотека (PubMed), особено между 2012 и 2015 г., и (B) прогнозната горна концентрация на биологичния обект на грам непреработени човешки изпражнения, както е цитирано в текста. Оценките не отразяват непременно жизнеспособния брой на биологичния обект, а концентрацията на археите се изчислява чрез метаногенен тест за дишане, който не се основава единствено на присъствието на археи. Концентрациите на метаболити, протести и други образувания не са идентифицирани.

Няколко анализа съобщават за клинично разрешаване на инфекцията с Clostridium difficile (CDI) [1–5], въпреки че дългосрочните ефекти на трансплантациите са неизвестни [6]. Предварителните резултати също показват положителни резултати за инсулинова чувствителност [7], множествена склероза [8] и болест на Crohn [9]. Предполагаемият елемент, свързващ тези състояния, е бактериалната общност на червата и по този начин успехът на лечението с ентусиазъм се върти около чревни бактерии, които се считат за жизнеспособни в изпражненията. Има няколко проучвания върху мишки и хора, които потвърждават положителните ефекти на култивираните бактерии върху CDI [10,11] и лигавичната бариерна функция [12]. Освен това микробната част от човешкия стол може да бъде силно обогатена от друг фекален материал чрез микрофилтрация [13,14], фракциониране на спорите [15] и градиенти на плътността [16].

Тук ние предварително подчертаваме, че жизнеспособните бактерии може да не са единственият участник в донорните изпражнения, които засягат биологията на реципиента, факт, който е добре оценен от експертите. Вирусите, археите, гъбите, животинските колоноцити, протестите и редица метаболити, които коменсалните бактерии произвеждат или зависят от тях, могат потенциално да се появят в непреработени изпражнения. Тук акцентираме върху моделите, наблюдавани при анализите на фекалния състав и различни експерименти, които осветяват функционалните ефекти на отделните компоненти на фекалната материя. Ние също така подчертаваме важни и проследими въпроси, за които по-нататъшният редукционизъм би могъл да помогне да се деконструира ползата от съставните части на фекалната материя.

Фекален състав

Човешкият фекален състав не е интензивно проучен. Изследванията, които са изследвали състава, са предимно от 70-те и 80-те години и отчитат различни резултати, може би поради вариации в диетата и здравето. Средно фекалните вещества за възрастни се оценяват на 75% вода и 25% твърдо вещество [17]. По-голямата част от твърдото вещество е органичен материал, чийто състав се състои от 25% -54% микробни клетки (с малка част, вероятно състояща се от вируси), които могат да бъдат живи или мъртви [18]. Тъй като броят на микробите се основава на светлинна микроскопия и модификация на оцветяването по Gram, се счита, че микробните клетки са предимно бактерии [18], но липсват доказателства за качество. Няколко други компонента се намират в значителна концентрация, включително археи, гъби и микробни еукариоти. Един конкретен вид метаноархеон, Methanobrevibacter smithii, е открит при 95,7% от пациентите, обхващащи бебета, възрастни и възрастни хора [19], и може да включва до 10% от всички фекални анаероби [20]. Жизнеспособните колоноцити също се изолират лесно от изпражненията на новородени и възрастни [21–23]. Не е докладван анализ на техния потенциален принос за успеха на фекалните трансплантации. Необходими са независими валидизации на тези оценки, особено измервания, които разглеждат всички обекти наведнъж.

Въпреки че трансплантациите могат да бъдат високоефективно лечение в определени случаи, остават опасения относно хипотетичния съвместен трансфер на патогенни микроби [24]. Замърсяването с микроби от околната среда също е риск по време на събирането, съхранението и боравенето с изпражненията на донорите, както се наблюдава в ранните периоди на съхранение на кръв за преливане [25,26]. За да се стандартизират лабораторните протоколи и да се подобри стабилността на фекалните вещества, една от възможностите е да се използват замразени донорски материали от стриктно проверени доброволци. Няколко проучвания сравняват ефикасността на замразено спрямо прясно изпражнения при повтарящи се или рефрактерни CDI и отчитат малка или никаква разлика [14,27,28]. Широкият надлъжен скрининг на донори на изпражнения е от съществено значение за проследяване на дългосрочния успех на лечението и са необходими по-нататъшни метагеномни проучвания на предадения фекален материал и умения за прехвърляне на реципиенти.

Бактерии

Други проучвания предполагат, че взаимодействията между генотипа на гостоприемника и микробиотата могат потенциално да повлияят на резултатите от трансплантацията. В колекция от проучвания даренията на човешки фекалии от свързани донори показват малко по-висока резолюция в случаите на CDI (93%) в сравнение с несвързани донори (84%) [34]. Това наблюдение е забележително в светлината на неотдавнашната констатация, че генетичните вариации на човека са в значителна корелация с вариациите в състава на бактериалната общност [35,36]. Неотдавнашен метаанализ обаче не показа значителна разлика в ефикасността между сродни и несвързани донори [37]. Освен това, плацебо-контролирано проучване доведе до успешното лечение на седем от девет души, получили трансплантация от един, несвързан донор [38]. По този начин, доказателствата към днешна дата показват, че родството има малък или никакъв ефект върху лечението на CDI.

За да демонстрират, че бактериите пряко допринасят за разрешаването на болестта, няколко изследователски групи са тествали дали обогатените бактериални части от фекален материал могат да бъдат ефективни при лечението на CDI при мишки и хора. Използването на шест вида коктейлна терапия потиска рецидивиращия CDI при 92% от мишките [10], когато приблизително 10 10 клетки на бактериален вид са били вкарани в реципиенти. В друго проучване на мишки, 10 8 образуващи колонии единици от един бактериален изолат, Lachnospiraceae D4, са причинили над 10-кратно намаляване на броя на образуващи колонии C. difficile единици на грам цекулозно съдържание [39]. Коктейл от нетоксигенни спори на C. difficile също беше успешно използван за потискане на рецидивите на CDI при изпитване при хора [40]. На 26 седмици от лечението, само 0% -5% от пациентите от различни лечебни групи са имали токсигенна C. difficile в изпражненията. Тези проучвания показват, че култивираните бактерии в определени случаи могат да допринесат ефективно за разрешаването на CDI заболяването.

Вируси

Вирусите от еукариоти, бактерии и археи са по-малко изучени компоненти на чревната микробиота, отколкото бактериите. От пет фекални проби, изчисленията на броя показват, че изобилието от вируси варира от 10 8 до 10 9 вируса на грам фекалии (мокро тегло), а средното съотношение вирус към бактерия е 0,13 [41]. Тези оценки са сравнително ниски от тези, съобщени в други среди, където съотношението между вируси и микробни клетки варира от 1,4 до 160 [42], което подкрепя възникващото схващане, че вирусите проявяват по-умерен начин на живот в червата [43,44]. Освен това, скорошно метагеномно проучване демонстрира, че многобройни умерени фаги се прехвърлят по време на фекални трансплантации [24]. Профагите често помагат за контролиране на нахлуващи патогени, модулиране на структурата на общността и поддържане на чревната хомеостаза [44]. Доминирането на умерените вируси обаче е типично за здравословни контролни изпражнения, тъй като пациентите, страдащи от заболявания на червата, могат да имат увеличени количества вирулентни фаги [45]. Един от най-разпространените, консервирани и разпространени бактериофаги в човешките черва е crAssphage [46], констатация, която предполага, че някои фаги могат да бъдат силно консервирани в човешката популация.

Въздействието на бактериофагите върху човешкото здраве се разглежда активно. Фаговата терапия включва изолиране и инокулиране на фаги (или техните антибактериални ензими), насочени към определена бактерия. Въпреки че не всички фагови лечения са ефективни [47], няколко експеримента in vitro и in vivo са успешни. Като лечение на CDI, 10 8 образуващи плака единици на mL от специфичен фаг са въведени в модел на човешко дебело черво. В продължение на период от 35 дни лечението причинява значително намаляване на вегетативните клетки C. difficile (макар и да има увеличение на спорите на C. difficile), както и производството на токсини до нива под прага на откриване на анализа [48]. Контролните реплики съдържат високи концентрации както на вегетативни клетки, така и на токсин. Фаговата терапия на CDI в модел на хамстер също значително забавя бактериалната колонизация и появата на симптоми [49]. Специфични фагови коктейли на теория биха могли да позволят на коменсалните бактерии, които са в конкуренция с C. difficile, да се оцветят отново в червата [50]. Докато фаговете C. difficile в крайна сметка могат да се превърнат в терапевтични средства, все още няма доказателства, че фаги, специфични за C. difficile, се прехвърлят при фекални трансплантации.

Има няколко опасения относно безопасността на фаговата терапия. За да се облекчи задържането, скорошно клинично изпитване при хора орално инокулира група от 15 субекта с висока доза от 17 фагови групи, насочени към инфекция с Escherichia coli и Proteus и не откри неблагоприятни ефекти [51]. Коктейлите за фагова терапия непрекъснато демонстрират потенциал за насочване и елиминиране на специфични вирулентни бактерии, като същевременно се избягват неблагоприятни ефекти, типични за антибиотиците (напр. Резистентност, диария и др.) [52–54]. Потенциален недостатък обаче е рискът от развитие на бактериална резистентност към фаги [55,56], въпреки че фагите могат потенциално да развият механизми за противодействие. Освен това проучванията при хора, включващи фаготерапия, са относително малки в момента. Необходими са по-големи кохорти от пациенти и по-нататъшни проучвания на дозите на фаги, еволюция на обхвата на гостоприемниците на фаги и бактериална резистентност [56], както и стабилността на лекарства на базата на фаги.

Археи и гъби

Човешки колоноцити

Интересното е, че жизнеспособни епителни клетки на дебелото черво или колоноцити могат да бъдат изолирани при концентрация до 10 7 на грам мокър фекален материал [23]. Жизнеспособни клетки на дебелото черво са ефективно изолирани от фекални проби от новородени (> 80% жизнеспособни) [21] и биопсични проби от крипти на дебелото черво (> 98% жизнеспособни) [22]. Изолирането е възможно поради еластичната способност на колоноцитите да приемат кълбовидна форма и да оцелеят, след като се ексфолират във фекалния поток [69]. По този начин тяхната жизнеспособност и частична функционалност вероятно се запазват в хода на някои трансплантационни лечения, особено при животински модели, които използват хранене или орален сондаж на фекален материал.

Действайки като физическа бариера между бактериите и вътрешните тъкани и органи на гостоприемника, колоноцитите позволяват толерантност към гостоприемника на чревната микробиота [70]. Когато настъпят високи нива на смърт на колоноцитите, тяхната посредническа роля се разпада поради повишената чревна пропускливост [71]. В действителност, основните патологични състояния на червата са свързани с промени в растежа и функциите на епител на дебелото черво [22,72], подобни на промените, често наблюдавани при проучвания на микробиота. Възстановяването им е ключово за успешното възстановяване от такива състояния. Неотдавнашно проучване трансплантира здрави жизнеспособни стволови клетки на дебелото черво в имунодефицитен модел на мишка с повърхностно увреждане на дебелото черво и установи, че клетките се интегрират лесно и един слой епител напълно покрива области без колоноцити [73]. Наличието на стволови клетки на дебелото черво в изпражненията все още не е регистрирано, въпреки че едно проучване възстановява стволови клетки от епител на дебелото черво, които често се отделят във фекалния поток [74]. Ако стволовите клетки на дебелото черво се идентифицират във фекалиите при модели на хора или животни, те могат да повлияят на успеха на трансплантациите, ако могат да присаждат реципиенти.

В допълнение към колоноцитите, молекули като имуноглобулин А (IgA) могат да действат като първа защитна линия за чревния епител [75]. IgA подсилва чревната бариера и защитава клетките гостоприемници срещу патогени и ентерични токсини в червата [75]. Например, IgA значително инхибира свързването на токсина на C. difficile с мембраните на граничните четки на хамстер в сравнение с контрола [76]. По същия начин човешките епителни клетъчни линии с IgA, добавен към повърхността им, показват намаляване на свързаната с C. difficile патология в сравнение с клетките, в които липсва IgA [77]. Остава да разберем дали въвеждането на IgA директно при хора ще бъде от полза.

Метаболити

Добре известно е, че фибрите се метаболизират от чревни бактерии, за да произвеждат късоверижни мастни киселини (SCFA), които имат видни противовъзпалителни и индуциращи Т клетки клетки в дебелото черво [78–80]. Фибрите силно допринасят за фекалното тегло и диетите с ниско съдържание на фибри при мишки могат да доведат до необратима загуба на бактериално разнообразие [81]. Докато директното повторно въвеждане на липсващите фибри в това проучване не възстанови разнообразието, трансплантациите от мишки с диета с високо съдържание на фибри го направиха. Освен това диетите с ниско съдържание на фибри водят до „гладуване на микроби“, при което веднъж коменсалните бактерии атакуват чревната лигавица [82]. Влакнестите добавки, използвани в проучване с заразени с C. difficile хамстери, обаче успяха да модулират значително времето на поява на системни симптоми [83]. Приемът на фибри също е свързан с повишено микробно разнообразие и намалено затлъстяване при хората [84,85].

Обобщение

Тук внимателно отбелязваме, че бактериите, жизнеспособни или нежизнеспособни в прехвърлен фекален материал, може да не са единственият играч в донорните изпражнения, който засяга биологията на реципиента. От една страна, ефектите на бактериите върху CDI или черти на животински модел като затлъстяване [100] и толерантност към токсини [101] изглеждат добре обосновани досега. От друга страна, в по-широк контекст, при който фекалните трансплантации се използват единствено при проучвания на животински модели и други човешки заболявания, разумният редукционизъм изглежда оправдан в светлината на ограниченото разбиране на сложния характер на изпражненията. Деконструирането на ползата и взаимодействията на съставните части на фекалната материя ще изясни относителната важност и причинно-следствената връзка на всеки от тези компоненти и потенциалното развитие на специфични терапии.

Ключови точки и бъдещи указания

Няколко проучвания с използване на коктейли от бактерии в животински модели и хора показват потискане на CDI. Тези проучвания обаче са предварителни и ограничени.

Чрез бактериално насочване, фаговата терапия може потенциално да елиминира вирулентните бактерии в болното черво и да позволи на коменсалната бактерия да се възстанови отново.

Колоноцитите предотвратяват бактериалната транслокация във вътрешните тъкани и органи; трансплантациите на здрави жизнеспособни стволови клетки на дебелото черво в модели на мишки водят до възстановяване на повърхностни увреждания на дебелото черво.

Метаболитите могат да подхранват колоноцитната бариера и чревните бактерии. Пероралното приложение на метаболити може да облекчи възпалението, увреждането на лигавицата и симптомите на множествена склероза. Въпреки това, само 5% от SCFAs, произведени в дисталното дебело черво, се оценяват на екскреция във фекалиите [102]. Следователно, концентрациите на метаболити вероятно са много по-ниски от концентрациите, използвани при проучвания за перорално приложение.

Археите и гъбите са често срещани във фекалиите. Въпреки че високите концентрации на чревни археи и някои гъбички са свързани както с чревни, така и с автоимунни заболявания, техните причинни ефекти са неизвестни.

Генетичната свързаност на човека има малко или никакво влияние върху ефективността на човешките фекални трансплантации, въпреки че генетичните фактори оформят състава на бактериалната общност.

Отделните компоненти на фекалните вещества могат да донесат ползи за здравето и могат да работят синергично за възстановяване на хомеостазата. Има предпазлива нужда от продължителен редукционизъм, за да се разбере точната полза и взаимодействието на различни фекални компоненти.

Благодарности

Благодарим на Шон Дейвис, Кен Лау, Винсент Йънг, Кевин Кол, Майк Садовски и Джоузеф Закулар за предоставената полезна обратна връзка за ръкописа.

Съкращения

CDIИнфекция с Clostridium difficile
IgAимуноглобулин А
SCFAкъсоверижни мастни киселини

Отчет за финансиране

Тази работа беше подкрепена от наградите на Националната научна фондация DEB 1046149 и IOS 1456778. Финансиращите нямаха роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.