• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: chen.vicky @ mayo.edubrimijoin @ mayo.edu

Редактирано от Джефри М. Зигман, Югозападен медицински център на Тексаския университет и прието от члена на редакционния съвет Дейвид Дж. Мангелсдорф 25 август 2017 г. (получено за преглед на 19 април 2017 г.)

мишки

Значимост

Затлъстяването е основен проблем за общественото здраве, засягащ физическото и емоционалното благосъстояние. Въпреки че програмите, базирани на начина на живот, могат да помогнат при отслабване, избягването на възстановяването на теглото е почти невъзможно поради постоянни хормонални адаптации. Тук, при модели на мишки, ние изследвахме по-ефективна стратегия, използваща вирусен генен трансфер на бутирилхолинестераза (BChE) за контрол на медииращия апетита хормон ацил-грелин. Установихме, че еднократното инжектиране на BChE вектор води до висока експресия на ензима за цял живот и по-ниска циркулация на ацилгрелин. Същото лечение потиска постдиетичната хиперфагия, коригира метаболитните лезии и намалява възстановяването на теглото. Този резултат потвърждава въздействието на оста BChE-грелин върху телесното тегло и показва, че трансферът на гени BChE може да бъде успешна стратегия за дългосрочен контрол на затлъстяването и „метаболитния синдром“.

Резюме

Затлъстяването се превърна в глобална пандемия благодарение на обезогенната среда с обилна калорична храна, пасивно забавление като норма и малко физическа активност. Над една трета от възрастното население на света е с наднормено тегло или затлъстяване и разпространението непрекъснато нараства (1). Много хронични заболявания и състояния се причиняват пряко или се насърчават от затлъстяването, като захарен диабет, рак, сърдечно-съдови заболявания, хипертония и остеоартрит, които намаляват качеството на живот и дълголетието (2). Има спешна нужда да се обърнат тези тенденции чрез предотвратяване и управление на затлъстяването.

Калорийното ограничение (CR) е често срещана стратегия за бързо намаляване на телесното тегло, полза за метаболизма и увеличаване на продължителността на живота (3, 4). Въпреки това, повечето хора със затлъстяване, които спазват диета, не успяват да поддържат намалено тегло в дългосрочен план и излишните им телесни мазнини представляват почти непреодолимо предизвикателство (5). След загуба на тегло възникват остри компенсаторни промени, включително значително намален разход на енергия и дълбоко повишен апетит (6). По този начин битката срещу затлъстяването и възстановяването на теглото прилича на тази с наркомания. Разбирането на бариерите пред дългосрочната загуба на тегло е ключово за избягване на рецидив на затлъстяването.

Телесното тегло се контролира от централната нервна система, тъй като периферните хормонални сигнали се интегрират в хипоталамуса, за да регулират приема на храна и енергията (7). След загуба на тегло изобилието от хормони, които регулират телесното тегло, започва да се променя (8). Ацил-грелинът е ключов хормон, предаващ метаболитна информация от периферията към централните системи. Този пептид се освобождава главно от стомашно-чревния тракт, но може да премине през кръвно-мозъчната бариера, за да активира орексигенен невропептид Y (NPY)/свързани с аготи протеини (AGRP) чрез рецептори на секретагог на растежен хормон (GHSR1a) (9, 10). Този „хормон на глада“ се повишава малко преди хранене и след това пада (11). В съответствие с неговия орексигенен ефект върху приема на храна, плазменият ацил-грелин е висок, когато енергийният баланс е отрицателен и нисък, когато е положителен (12, 13). Последните проучвания показват, че чувствителността към рецепторите на грелин също отговаря на телесното тегло. По този начин, индуцираното от диетата наддаване на тегло причинява централна резистентност към грелин (14), докато CR и загубата на телесно тегло възстановяват чувствителността на рецептора (15). Наскоро Zigman et al. (16) повдигна идеята, че предизвиканата от затлъстяване централна резистентност към грелин може да бъде обърната чрез индуцирана загуба на тегло и че възстановената рецепторна чувствителност може да е основният фактор, който стимулира възстановяването на теглото.

Наскоро съобщихме, че ензимът бутирилхолинестераза (BChE) модулира грелиновата сигнализация, като разцепва n-октаноилната група на хормона и трансформира ацил-грелина в неговата неактивна или различно активна форма, дезацил-грелин (17 ⇓ –19). BChE се синтезира в черния дроб и се секретира в кръвообращението, но се експресира и в мозъка (20). Мащабни клинични проучвания са установили, че промененият серумен BChE корелира със затлъстяването, нарушен липиден метаболизъм, диабет тип 2 и повишени сърдечно-съдови рискове (21 ⇓ –23). Въпреки вероятното му клинично значение, малко проучвания са изследвали причинно-следствените връзки между BChE и затлъстяването. Последните ни открития показват, че BChE силно влияе върху метаболизма на мазнините и натрупването на телесни мазнини (24, 25). Тук ние предполагаме, че BChE регулира телесното тегло, като контролира сигнализирането на грелин по време на диета, индуцирана загуба на тегло и последващо възстановяване на теглото. За да тестваме тази хипотеза, ние приложихме стратегия, използваща вирусен вектор генен трансфер на BChE при мишки с диетични интервенции. Настоящите резултати показват, че трансферът на гени BChE може да доведе до дългосрочно намаляване на плазмения ацил-грелин и по този начин да окаже здравословно въздействие върху приема на храна, телесното тегло и хомеостазата на глюкозата.

Материали и методи

Животни и етика.

Мъжки мишки C57BL/6 са получени от Jackson Labs по протокол A53015, одобрен от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в клиниката Mayo. Експериментите бяха проведени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (26) в съоръжение, одобрено от Американската асоциация за акредитация на лабораторни грижи за животните. Осемседмични мишки с първоначално сходно телесно тегло се поддържат в продължение на 12 седмици в режим ad libitum chow или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (10% или 45% мазнини, Research Diets D12450H и D12451). След това мишките бяха поставени в една клетка и продължени с chow ad libitum (група 1), HFD ad libitum (група 2) или чау с 40% CR в продължение на 3 седмици (групи 3 и 4). CR групите консумираха диета с чау през третата седмица на CR, а количеството осигурени дневни калории беше 60% от това, което отделните мишки са яли през предходната седмица (40% CR). Експерименталната схема е показана на фиг. 1. След приключване на CR диетите с чау се предоставят ad libitum, докато експериментът приключи.

Експериментална схема. Осемседмични мъжки мишки C57BL/6 бяха разделени на четири групи по 10. Контролните мишки от Chow и HFD бяха хранени ad libitum през цялото време. CR + Luc и CR + BChE групи бяха третирани с AAV-Luc или AAV-BChE след 12 седмици HFD хранене и след това преминаха към чау с 40% CR за 3 седмици, последвано от ad libitum чау още 12 седмици. Количеството дневни калории, осигурено за CR мишките, е 60% от това, което отделната мишка е яла през предходната седмица на HFD хранене. Показани са времеви точки за ключови експериментални процедури, включително вирусно инжектиране, ежедневно измерване на храна, тест за толерантност към глюкоза (GTT), цялостна лабораторна система за наблюдение на животни (CLAMS) и предизвикателство за ацил-грелин.

Интравенозно инжектиране.

сДНК, кодираща луцифераза (Luc) или мишка BChE, е субклонирана в адено-асоцииран вирус (AAV). Получените вектори на вирусен трансфер бяха котрансфектирани в клетки HEK293T с pHELP (Applied Viromics) и pAAV 2/8 (University of Pennsylvania), както е описано по-рано (27). Вирусът в клетъчните лизати се изолира чрез ултрацентрифугиране за количествено определяне чрез PCR в реално време. Вектор (100 µL, 10 13 вирусни частици през опашната вена, промита с 200 µL стерилен 0,9% NaCl) се дава на 20-седмични мишки след 12 седмици HFD.

Състав на тялото и енергийни разходи.

Мастната маса и чистата маса бяха оценени в анализатор за телесен състав (EchoMRI LLC). Консумацията на кислород (VO2), изтичането на въглероден диоксид (VCO2) и енергийните разходи се измерват чрез индиректна калориметрия в цялостна лабораторна система за наблюдение на животните (Columbus Instruments), която поддържа постоянна температура на околната среда (22 ° C) при 12-часова светлина, 12 -h тъмен цикъл. Спонтанната двигателна активност се записва автоматично и се оценява като общ брой на амбулациите в рамките на 24-часов наблюдателен прозорец.

Прием на храна.

Приемът на храна се определя ежедневно в продължение на 2 седмици при единично настанени мишки с постелки, заменени с изо-подложки, за да се даде възможност за отчитане на всяко зърно остатъчна храна. Всеки ден се предоставяха нови хранителни гранули и остатъкът се измерва 24 часа по-късно.

Ефекти на ацил-грелин върху освобождаването на растежен хормон.

Мишките бяха настанени в тиха и изолирана процедура за стая 1 час преди експеримента. След това те бяха упоени с пентобарбитал (50 mg/kg, i.p.) и, 10 минути по-късно, дадени i.p. човешки ацил-грелин (0,5 mg/kg; Phoenix Pharmaceuticals). Кръв за анализ на растежен хормон се събира преди и 3, 10 и 20 минути след инжектиране на ацил-грелин.

Въздействие на ацил-грелин върху апетита.

Един час преди тестването, мишките бяха заселени в произволен ред в изолирана процедурна стая. След предишна процедура (28), мишките след това получиха физиологичен разтвор i.p. и разрешен достъп до храна. Приемът на храна е измерен 30 минути по-късно. Петнадесет минути по-късно същите мишки получават 0,5 mg/kg човешки ацилгрелин. Приемът на храна се измерва на 30 минути и 60 минути след инжектирането на ацилгрелин, за да се получат първите 30 минути и вторите 30 минути прием на храна.

Анализ на плазмата.

Кръв (∼0,2 ml) се взема с ланцет на мишка чрез пункция с една буза между 9:00 и 10:00 и кървенето се спира със стерилна марля. Проби от грелин се събират в охладени обработени с EDTA епруветки с 0,1 об. 1 М НС1 и протеазни инхибитори (1 тМ р-хидроксимеркурибензоена киселина, Sigma-Aldrich; 1,5 цМ апротинин, Roche). Пробите се центрофугират в продължение на 10 минути при 8000 × g и се съхраняват при -80 ° С. Комплектите ELISA бяха използвани за измерване на нивата на инсулин (Alipco), ацил-грелин и дезацил-грелин (Cayman Chemical), като коефициентите на вариация на взаимодействие са съответно 4,0%, 3,8% и 6,7%. BChE активността се определя чрез анализ на Ellman, както е описано по-горе (29).

Тест за толерантност към глюкоза.

Шестчасови гладни мишки (еднокамерни в произволен ред) получават 1,2 g/kg глюкоза чрез i.p. инжекция. Кръвната глюкоза се проследява преди инжектирането и 20, 40, 60, 90 и 120 минути след това.

Генната експресия.

Хипоталамусът и хипофизата се събират под анестезия с 50 mg/kg пентобарбитал и се перфузират с ледено студен физиологичен разтвор. Общите РНК се екстрахират с TRIzol (Invitrogen) и 1-μg аликвотни части се обработват с комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems). PCR в реално време се извършва със система за откриване CFX384 (Bio-Rad). Последователностите на PrimeTime Предварително проектирани праймери (Integrated DNA Technologies) са в Таблица S1.