1 Държавна ключова лаборатория за изследване на качеството в китайската медицина и Институт по китайски медицински науки, Университет в Макао, Макао

ефект

2 Катедра по биоинженерство, кампус Zhuhai на Медицинския университет Zunyi, Zhuhai, Китай

3 Отделение по гастроентерология, болница Kiang Wu, Макао

4 Катедра по фармакология и фармация, Университетът в Хонг Конг, Хонг Конг

5 Втората свързана болница на Гуанджоуския университет по китайска медицина, провинциална болница по китайска медицина Гуангдонг, Гуанджоу, Гуангдонг, Китай

Резюме

Успоредно с метаболитния синдром на разпространението, неалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) се превърна в най-често срещаното хронично чернодробно заболяване в повечето страни. Отличава се със съзвездие от проста стеатоза, неалкохолен стеатохепатит (NASH), фиброза, цироза и дори хепатоцелуларен карцином. Няма одобрени лекарства за ефективно управление на NAFLD и NASH. Формулата на Jianpi Huoxue (JPHX) се състои главно от макроцефал Atractylodes (Baizhu), Salvia miltiorrhiza (Даншен), Rasux Paeonia Alba (Baishao), Rhizoma Alismatis (Зекси) и Fructus Schisandrae Chinensis (Вувейзи), което може да има благоприятен ефект върху NAFLD. Целта на проучването е да идентифицира ефекта на JPHX върху NAFLD. Модел на NAFLD се индуцира от храна с дефицит на метионин-холин (MCD) при плъхове Wistar и се прилага перорално с едновременно JPHX, веднъж дневно в продължение на 8 седмици. Бяха оценени хепатоцелуларни увреждания, липиден профил, възпаление, фиброза и апоптоза. Резултатите показват, че JPHX значително намалява анормалните нива на серумна аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST) в сравнение с модела MCD (P

1. Въведение

В китайската философия на медицината патогенезата на NAFLD включва вакуума на далака, стагнация на черния дроб и запушване на влажни храчки. Досега са проучени малко традиционни китайски лекарства за лечение на пациенти с НАЖБП [8–10]. Jianpi Huoxue (JPHX), като китайска билкова формула, се използва за чернодробни заболявания в Китай в продължение на много години [11]. JPHX се състои главно от макроцефални Atractylodes (Baishu), Salvia miltiorrhiza (Даншен), Rasux Paeonia Alba (Baishao), Rhizoma Alismatis (Зекси) и Fructus Schisandrae Chinensis (Вувейзи) и укрепва далака, омекотява черния дроб, разсейва влагата, разтваря застоя и подпомага кръвообращението [12, 13]. JPHX съдържа активни съединения, които могат да регулират липидния метаболизъм и да проявяват противовъзпалителни свойства. Целта на изследването беше да се определи ролята на JPHX в развитието на MCD, индуцирана от диетата NAFLD при плъхове.

Ние предположихме, че JPHX може да има хепатопротективен ефект по време на прогресията на NAFLD. Клинично NAFLD се характеризира с повишени серумни аминотрансферази, натрупване на мазнини с повече от 5% хепатоцити и без анамнеза за злоупотреба с алкохол [1, 5, 14]. Животинските модели на NAFLD могат да се предизвикат при гризачи, както при много други човешки заболявания, чрез общи диетични протоколи и да се използват за разработване на нови терапевтични подходи и изследване на болестните механизми [15]. MCD диетата се използва повече от 40 години за индуциране на NAFLD, като класически модел, който показва чернодробни хистологични характеристики, включително стеатоза, възпаление и фиброза за кратко време [16]. В настоящото проучване, MCD-индуцирана NAFLD при плъхове се използва за изследване на JPHX като терапевтичен агент за NAFLD.

2. Материали и методи

2.1. Модели на животни

Мъжки плъхове Wistar, тежащи приблизително 220 g, са хранени с дефицит на метионин и холин (MCD диета) (Trophic Animal Feed High-Tech Co., Ltd., Nantong, China), който съдържа аминокиселини, царевично масло, фибри, витамини, минерали, натриев бикарбонат и третичен бутилхидрохинон (TBHQ) или същата диета, допълнена с метионин и холин (MCS диета) за период до 8 седмици. Основата на плъховете Wistar са плъховете Wistar IGS, които са безплодни. Всички плъхове бяха разделени на случаен принцип в пет групи (6-9 плъхове на експериментална група), включително MCS група, MCD група и JPHX 0,60 g/kg, JPHX 1,21 g/kg и JPHX 2,42 g/kg групи. Плъховете бяха настанени на групи от по 2 души

4 в IVC клетки с удобни легла, а помещението за животни с 12-часова температура на цикъла тъмно/светло варира между 21 и 25 ° C; влажността се поддържа между 55% ​​и 65%. Всички плъхове имаха свободен достъп до храна и вода и се претегляха на интервали от седмица.

2.2. Формула JPHX

Формулата JPHX е предоставена от Shanghai Sunrise Traditional Chinese Medicine Co., Ltd., Шанхай, Китай. Моделът NAFLD се индуцира чрез MCD диета при плъхове, прилагани перорално едновременно с JPHX веднъж дневно, докато плъховете бъдат жертвани. Формулата JPHX има дълга история на употреба в клиничната практика в Китай, поради което различните дози JPHX са избрани според предишния клиничен опит. Дозата на плъховете се преобразува от човешка доза, която се умножава по 7 в зависимост от телесната повърхност. Проучването за реакция на дозата е валиден дизайн на изследване за оценка на ефикасността на TCM [17–19]. Три дози формула JPHX се прилагат на плъхове. Плъховете в групата за лечение с JPHX се прилагат с JPHX в три различни дози от 0,60, 1,21 или 2,42 g/kg (тегло на плъх). Формулата на прах (10.00 g) се разтваря в 50 ml дестилирана вода и след това плъховете се прилагат перорално с разтвор JPHX в зависимост от телесното им тегло. MCS групата и MCD групата носители се третират орално с дестилирана вода. Проучването върху животни отговаря на етичните стандарти (UMARE-001-2017) на Института по китайска медицинска наука към Университета в Макао.

2.3. Определяне на биохимичните параметри на серума и черния дроб

Кръвни проби се събират на всеки 2 седмици от венозната вена и могат да се получат 1-2 ml кръв и да се центрофугират при 1000 r.c.f за 15 минути при 4 ° C. Серумът е отделен за откриване на биомаркери, включително аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), триглицерид (TG) и общ холестерол (TC) (Nanjing Jiancheng Biotech Co., Nanjing, Китай). Фактор на туморна некроза-α (TNF-α) нивата се измерват с ELISA комплект (Duo-Set; R&D Systems Inc., MN, Минесота, САЩ) и абсорбцията се отчита при 450 nm от четец за микроплаки съгласно инструкциите на производителя. В края на 8 седмици се събират кръвни проби от коремната аорта и могат да се вземат приблизително 5 ml кръв за анализ; чернодробните нива на TG и TC се определят от същия комплект, използван за серум, както беше описано по-рано [20]. Накратко, липидът се екстрахира с разтвор на хлороформ/метанол. Органичната фаза се събира и след това се изпарява и полученият сух прах се разтваря в изопропанол за откриване на чернодробни TG и TC. Активността на чернодробната глутатион пероксидаза (GPx) е открита за анализ на оксидативния стрес чрез търговски комплект от Nanjing Jiancheng Biotech Co. (Нанкин, Китай) [21].

2.4. Хистопатологичен анализ
2.5. Количествен анализ на верижна реакция на полимераза в реално време (qRT-PCR)

Пробите от пресен черен дроб бяха събрани и бързо замразени в течен азот и след това съхранявани при -80 ° C за допълнителен анализ. Общата РНК се екстрахира от чернодробна тъкан с реагент TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и се транскрибира обратно в cDNA, използвайки SuperScript обратна система (Invitrogen) за усилване съгласно протокола на производителя. Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR) се извършва от SYBR Премикс Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Takara, Shiga, Япония). Информацията за грундовете е посочена в таблица 1.

2.6. Западно петно

Чернодробната тъкан от различни групи се хомогенизира с топчета от неръждаема стомана в буфер за лизис RIPA от TissueLyser II (QIAGEN, Hilden, Германия) и след това се центрофугира при 12 500 r.c.f за 30 минути при 4 ° С. Получава се супернатант и концентрациите на протеини се определят чрез комплект за анализ на протеин на Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Равни количества маркери на протеини и молекулно тегло бяха заредени върху електрофореза на натриев додецил сулфонат полиакриламиден гел (SDS-PAGE). Протеиновите проби бяха прехвърлени в мембрана от поливинилиден дифлуорид (PVDF), която беше блокирана с 5% обезмаслено мляко в 1 × Tris-буфериран физиологичен разтвор с 0,5% Tween-20, за 1 час при стайна температура. Мембраните бяха инкубирани с първични антитела за една нощ при 4 ° С. Вторични антитела, свързани с пероксидаза от хрян (HRP) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) се инкубират при стайна температура в продължение на 1 час след измиване поне три пъти с буфериран с Tris физиологичен разтвор Tween 20 (TBST), по 10 минути всеки път . Сигналите бяха открити чрез ECL комплект за откриване (GE Healthcare, Милуоки, Уисконсин, САЩ) и количествено определени със софтуера Image Lab (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.7. Анализ на данните и статистика

Всички данни са събрани от три независими експеримента. Използва се студентски t-тест за сравняване на разликите между MCS групата и MCD групата. Различията между експерименталните групи бяха оценени чрез еднопосочен ANOVA, последван от тест за множество сравнения на Dunnett. Стойностите на Р под 0,05 се считат за статистически значими. Данните са описани като средно ± стандартни отклонения (SD). Алфа нивото беше с две опашки. Призмата GraphPad е използвана за статистически анализ (версия 6.0, GraphPad Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ).

3. Резултати

3.1. JPHX не влияе върху телесното тегло и съотношението тегло на черния дроб към тялото (LBW) в NAFLD

В нашето проучване JPHX беше извършен върху плъхове, използвайки модел на MCD, предизвикан от MCD NAFLD. Телесното тегло на плъхове, хранени с диета MCS, показва нарастваща тенденция, докато телесното тегло на плъхове, хранени с диета с MCD, постепенно намалява, приблизително с 20% -30%, през 8-те седмици на периода на тестване поради забележимо по-нисък калориен прием ( Фигура 1 (а)). Чернодробното тегло на групата с носители MCD и групата на лечение с JPHX са сходни (Фигура 1 (b), стр = 0,1608). В допълнение, съотношението на черния дроб/телесно тегло (LBW) при плъхове, хранени с диета с MCD, е по-високо от това при плъхове, хранени с диета MCS (Фигура 1 (в), стр
а)
б)
(° С)

стр стр стр
а)
б)
(° С)
(д)
(д)