Отделение по зоология, Университет в Мелбърн, Парквил, Виктория, Австралия

забавя

Отделение по зоология, Университет в Мелбърн, Парквил, Виктория, Австралия

Отделение по зоология, Университет в Мелбърн, Парквил, Виктория, Австралия

  • Натали К. Биндер,
  • Натали Дж. Ханан,
  • Дейвид К. Гарднър

Фигури

Резюме

В световен мащаб 48% от възрастните мъже са с наднормено тегло или затлъстяване. Понастоящем се приема връзка между безплодието и прекомерното телесно тегло, въпреки че фокусът остава предимно върху жените. Доказано е, че родителското затлъстяване води до компрометирано развитие на ембриона, непропорционални промени в метаболизма на ембриона и намаляване на броя на бластоцистните клетки. Целта на това проучване е да се определи дали затлъстяването по бащина линия има отрицателни ефекти върху получения ембрион. По-конкретно, използвайки ин витро оплождане (IVF), искахме да изолираме функционалните ефекти на затлъстяването върху сперматозоидите, като изследвахме последващия ембрион преди и след имплантацията. Епидидималните сперматозоиди са събрани от възрастово съвпадащи нормални и затлъстели мишки C57BL/6 и криоконсервирани за последващо IVF с ооцити, събрани от швейцарски жени (нормална диета/тегло). Затлъстяването се предизвиква при мъжки мишки чрез хранене с високо съдържание на мазнини от 22% мазнини в продължение на 10 седмици. Получените ембриони се култивират индивидуално и развитието се проследява с помощта на микроскопия с изтичане на времето. Затлъстяването на бащата доведе до значително забавяне в развитието на предимплантационния ембрион още когато сингамията (P 2) не беше нормално разпределена и статистически анализирана с тест на Ман-Уитни (непараметричен).

Трансфер на ембриони.

Съотношението на имплантирани ембриони на трансфер, развити на трансфер и развити на имплантация бяха сравнени между нормалните и затлъстелите групи с таблица за непредвидени обстоятелства и точния тест на Fisher. Теглото на плода и плацентата (g), дължината на кръста (mm) и морфологичната степен на плода обикновено не са разпределени и статистически анализирани с тест на Ман-Уитни (непараметричен).

Резултати

Диетични ефекти върху наддаването на тегло и отлаганията на мазнини

Мъжки мишки C57BL/6, хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 10 седмици (затлъстели), натрупват значително повече тегло, отколкото мишките, хранени с контролна диета (нормално), за да тежат значително повече по време на събирането на сперматозоиди (фигура 1). Затлъстелите мишки също имат значително увеличени перитонеални мастни натрупвания в сравнение с нормалните мишки, които не се нормализират с теглото (таблица 1). Такива промени в телесния състав при хранене с високо съдържание на мазнини в този щам на мишка са докладвани по-рано [4].

Тъмната линия представлява мишки, хранени с контролна диета (обозначена като нормална), а светлата линия представлява мишки, хранени с високомаслена диета (обозначена със затлъстяване). Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * P Таблица 1. Средно телесно тегло, промяна на телесното тегло и телесни мазнини при нормални и затлъстели мъжки мишки C57BL/6 след период на хранене от 10 седмици.

Ин витро оплождане (IVF)

Сперматозоиди от затлъстели мъжки оплодени ооцити със значително по-висока скорост от сперматозоидите от нормални мъже (41,82 ± 3,57% срещу 31,22 ± 3,01% съответно; P Таблица 2. Време на сингамия, 1-ви, 2-ри, 3-ти етапи на разцепване, образуване на кухина и започване на излюпване за ембриони, получени от спермата на нормални и затлъстели мъже.

Ефекти на затлъстяването върху потенциала на митохондриалната мембрана

Значително намаляване на интензивността на червената: зелена флуоресценция на сондата JC-1 се наблюдава при 4-клетъчни ембриони, получени от спермата на затлъстели мъже в сравнение с нормалното (фигура 2А). Тази разлика показва намален митохондриален мембранен потенциал на 4-клетъчни ембриони, получени от затлъстели мъже. Измерено едновременно, усвояването на пируват от тези 4-клетъчни ембриони е значително увеличено (фигура 2В).

Тъмните ленти представляват ембриони, получени от нормални мъжки сперматозоиди, а светлите ленти представляват ембриони, получени от затлъстели мъжки сперматозоиди, както за митохондриалния мембранен потенциал (A), така и за поемането на пируват (B), на 4-клетъчния етап. Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * P Фигура 3. ICM: TE е значително намален при ембриони от затлъстели мъже, докато общият брой на клетките е непроменен.

Тъмната част на лентите представлява средния брой клетки на трофектодерма, а светлата част - средния брой клетки на вътрешната клетъчна маса. Данните са изразени като средна стойност ± SEM. ** P Фигура 4. Израстъкът на бластоциста е значително намален при ембриони, получени от спермата на затлъстели мъже.

Тъмната линия представлява ембриони, получени от нормални мъжки сперматозоиди, а светлата линия представлява ембриони, получени от затлъстели мъжки сперматозоиди. Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * P Фигура 5. Наблюдавано е забавено морфологично развитие на плода при ембриони, получени от сперматозоиди на мъже със затлъстяване.

Типична фетална морфология в деня на псевдобременност на плода, генериран от нормални сперматозоиди (А). Ясно се наблюдават забавени морфологични характеристики и размер при фетусите, генерирани от сперматозоиди от затлъстели мъже (В). Изображения с по-висока мощност (увеличение с 4 пъти) на развитието на предните крайници при плодове, получени от нормални (C) и затлъстели (D) мъжки сперматозоиди. Изобразяване на дефинирани цифри в нормата (C) и забавено развитие на предния крайник и цифри при плодове, получени от затлъстели мъжки сперматозоиди (D). Мащабна лента = 1 мм.

Дискусия

Въпреки че наскоро беше показано отрицателното въздействие на затлъстяването върху качеството на ембрионите [4], [18], [19], основните механизми тепърва ще бъдат изяснени. Освен това степента на ефекта на затлъстяването, ако има такъв, върху параметрите на спермата остава неубедителна. Данните от това проучване демонстрират за първи път, че затлъстяването влияе отрицателно върху функционалната способност на спермата да генерира висококачествен ембрион, способен да постигне здравословна бременност. Включването на ин витро оплождане в модел на затлъстяване, предизвикано от баща, намалява ефекта на объркващи фактори като промени в състава на семенната течност, време на оплождане и поведение на чифтосване. Оплождането на ооцитите със спермата на затлъстели мъже е довело до значителни промени в получената ембрио митохондриална активност и кинетично развитие. Докато промените бяха разрешителни за образуването на бластоцисти - макар и с намалена честота - разпределението на клетъчните линии варираше значително от нормалното и развитието на плода и плацентата беше компрометирано.

Нашият модел за ин витро оплождане, комбиниран с микроскопия със закъснение, за първи път показа, че затлъстяването на бащата засяга кинетиката на развитието на ембрионите още при сингамия, причинявайки приблизително 15 минути забавяне на пронуклеарното сливане. Тази сравнително малка разлика във времето може да бъде открита поради строго контролираното ни време на оплождане и използването на висока времева микроскопия. За разлика от други видове бозайници, сперматозоидите на мишки не допринасят за центриола към оплодения ооцит и като такъв няма участие на баща в организацията на астрата, която събира мъжките и женските пронуклеуси заедно. Вместо това бихме предположили, че това забавяне в сингамията може да се дължи на промени в декондензацията на хроматин, тъй като полиамините, заобикалящи мъжката пронуклеарна ДНК, се заменят с хистони на ооцитите. Това наблюдавано забавяне в кинетичното развитие се влошава при второто събитие на разцепване до приблизително 1 h, в резултат на удължаване на продължителността на клетъчния цикъл от 2- до 3-клетъчния стадий, съвпадащо с активирането на ембрионалния геном. Това засилва предишните ни открития и осигурява допълнителна подкрепа за генетичния ефект на затлъстяването на бащата върху репродуктивната годност [4].

Като се има предвид това, бяха извършени израстъци на бластоцисти и трансфери на ембриони, за да се определи дали има функционален ефект от това намаляване на ICM. Ембрионите, получени от спермата на затлъстели мъже, са имали значително намалена способност да надраснат в продължение на 72 часа култура, в съответствие с предположението, че намалената ICM ще корелира с намаления капацитет за израстване. Морфологично подобни бластоцисти от двете бащини групи бяха прехвърлени на псевдо бременни жени реципиенти. Подобно на констатациите на Mitchell и колеги [18], затлъстяването по бащина линия е свързано със значително намаляване както на имплантацията, така и на продължаващата честота на бременност. Настоящото проучване обаче също така показва значително намаляване както на теглото на плода, така и на плацентата, дължината на кръста и морфологията на крайниците при бащинско затлъстяване. Намаленото тегло на плода може да се дължи директно на намалена ICM или да отразява промени във функцията на плацентата [47], [48]. В модел на нарастващо митохондриално инхибиране [49], митохондриалната дисфункция влияе значително върху нормалното ембрионално, фетално и плацентарно развитие. Като такова би могло да се предположи, че намалената митохондриална активност, показана на 4-клетъчния стадий, е ключов фактор за неблагоприятните резултати от бременността, свързани с предизвиканото от баща затлъстяване.

Идентифициран за първи път в това проучване, намаленият растеж на плацентата и плода, свързан със затлъстяването по бащина линия, е в контраст с ефекта на затлъстяването при майките върху бременността, което корелира значително с честотата на големи раждания в гестационна възраст [50], [51]. Намаленият растеж на плацентата обикновено предшества намаления фетален растеж [52], [53], а размерът на плацентата е идентифициран като независима детерминанта както на вътрематочния фетален растеж, така и на теглото при раждане [54]. Бащино експресираните импринтирани гени са склонни да засилят растежа на плацентата [55]. Като такива, грешките в отпечатването или епигенетичните промени, възникващи по време на сперматогенезата, биха могли да допринесат за намаляване на плацентарния и последващ растеж на плода, свързан със затлъстяването на бащата. Намаленият вътрематочен растеж е добре установен рисков фактор за неблагоприятно дългосрочно здраве, увеличаващ вероятността от коронарна болест на сърцето, диабет тип 2, инсулт и хипертония в зряла възраст, независимо от начина на живот (за преглед [56]). Намаленият растеж на плода може също да промени реакцията на организма към храненето по-късно в живота. Малките за гестационна възраст потомци имат намалени пътища на нервна ситост на хипоталамуса, водещи до програмирано преяждане - създавайки самостоятелен увековечаващ цикъл на затлъстяване [57], [58].

В заключение, това е първото проучване, което комбинира ин витро оплождане (IVF) с индуцирано от мъжкото затлъстяване за изследване на функционалния ефект на мъжкото затлъстяване върху развитието на ембриона и бременността. Настоящото проучване ясно демонстрира, че има няколко последствия от затлъстяването при мъжете върху развитието на ембрионите, имплантацията, успеха на бременността и размера на плода. Промените в развитието на сперматозоидите, състава на семенната течност и поведението при чифтосване на животни при хранене с високо съдържание на мазнини вероятно ще повлияят допълнително на репродуктивния успех и изискват допълнителни изследвания. Освен това, проучвания, използващи едно до друго естествено чифтосване и in vitro култура, биха помогнали да се изяснят всички объркващи ефекти от криоконсервацията на сперматозоидите, IVF и условията на култивиране.