Разкриване на авторите: SR Hennigar, V Velasquez и SL Kelleher, без конфликт на интереси.

индуцираното

Stephen R Hennigar, Vanessa Velasquez, Shannon L Kelleher, Индуцираното от затлъстяването възпаление е свързано с промени в субклетъчните цинкови басейни и преждевременната инволюция на млечната жлеза при кърмещи мишки, Journal of Nutrition, том 145, брой 9, септември 2015 г., страници 1999–2005, https://doi.org/10.3945/jn.115.214122

Резюме

Заден план: Неуспехът на лактацията е често срещан при жени с наднормено тегло и затлъстяване; точният механизъм обаче остава неизвестен.

Обективен: Тествахме хипотезата, че индуцираното от затлъстяването възпаление в млечната жлеза (MG) преразпределя субклетъчните цинкови басейни, за да насърчи клетъчната смърт на епителните клетки на млечната жлеза (MEC) и преждевременната инволюция.

Методи: Женските мишки DBA/2J са хранени с високо съдържание на мазнини (затлъстели; 45% kcal от мазнини, n = 60) или контролна диета (постно; 10% kcal от мазнини, n = 50) за 5 седмици и са отглеждани. MG цитокините и инфилтрацията на макрофаги се определят чрез верижна реакция с обратна транскриптаза-полимераза и оцветяване F4/80, съответно. Концентрацията на цинк се анализира чрез атомно-абсорбционна спектроскопия, а цинковите транспортери и маркерите на ендоплазмен ретикулум (ER) стрес, автофагия и инволюция се измерват чрез имуноблот. За да се потвърдят ефектите от възпалението, тумор некротизиращ фактор-α (TNF) или носител се инжектира в съседни MG на слаби лактиращи мишки C57BL/6 (n = 5) и култивирани MECs (HC11 клетки) се третират с TNF in vitro.

Резултати: Седемдесет и седем процента от затлъстелите мишки не успяват да лактат (постно: 39%; P 2; постно: 63,8 ± 8,9 макрофаги/mm 2; P

Въведение

Над една трета от жените в репродуктивна възраст са с наднормено тегло (ИТМ: 25–29 kg/m 2) или със затлъстяване (BMI: ≥30 kg/m 2) (1). Наднорменото тегло или затлъстяването нарушава функцията на млечната жлеза (MG) 6 и компрометира способността за започване и поддържане на лактацията [прегледано от Jevitt et al. (2), Rasmussen (3) и Stuebe et al. (4)]; обаче биологичните механизми, отговорни за дефектите на лактацията при затлъстелите жени, не са добре разбрани.

Адипоцитите секретират редица провоспалителни цитокини, включително IL-6, IL-1β и моноцитен хемотактичен протеин 1 (MCP-1). В действителност, по-голяма експресия на TNF и IL-6 се открива в MG на плъхове със затлъстяване (5). Както TNF, така и MCP-1 действат като хемоаттрактанти за набиране на макрофаги (6), които от своя страна секретират цитокини като IL-6, TNF и фактор, стимулиращ колониите 1 (CSF1) (7), поддържайки провъзпалителния фенотип. Това е особено важно, тъй като е показано, че TNF активира постлактационната инволюция (8, 9). Освен това, както лактацията (10), така и затлъстяването (11) създават физиологични състояния на засилен стрес на ендоплазмен ретикулум (ER). ER сигналът за стрес задейства краткосрочния цитопротективен механизъм на разгънатия протеинов отговор (UPR), който координира затихването на протеиновия транслация с увеличаване на лизозомно-деградационния път, известен като макроавтофагия (тук наричан автофагия) и ER- асоцииран път на разграждане за защита срещу клетъчна смърт (12, 13). При продължителен ER стрес UPR намалява и се активират апоптотични механизми (14). По този начин епителните клетки на млечната жлеза (MECs) могат ефективно да управляват ER стреса и автофагията, присъщи на лактацията, но добавеният физиологичен стрес на затлъстяването може да насочи клетъчния фенотип към смърт.

Промените в субклетъчните цинкови пулове могат да бъдат в основата на активирането на автофагия, ER стрес и клетъчна смърт. Натрупването на цинк в лизозомите активира автофагията в култивираните неврони (15) и лизозомно-медиираната клетъчна смърт в MECs (9). Транспортерът на цинк 2 (ZnT2) обикновено внася цинк в секреторните везикули по време на лактацията (16) и не се намира в лизозомите в MG на мишки с нулипарни или кърмещи мишки или MEC (16, 17). Наскоро обаче установихме, че TNF преразпределя ZnT2 за натрупване на цинк в лизозомите и активира медиирана от лизозома клетъчна смърт на MECs по време на началната фаза на MG инволюция (9). В допълнение, изчерпването на ER цинк активира ER стрес (18–20), а мутациите на загуба на функция в ER износителя на цинк Catsup [човешки zrt-irt-подобен протеин 7 (ZIP7) хомолог] влошава секреторния трафик и активира клетъчната смърт (21). Тук тествахме хипотезата, че възпалителната микросреда в затлъстелите MG променя ER и лизозомни цинкови басейни, което води до секреторни дефекти, клетъчна смърт и преждевременна инволюция.

Методи

Мишовъдство.

Това проучване е одобрено от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните в държавния университет в Пенсилвания, който е акредитиран от Асоциацията за оценка и акредитация на лабораторни грижи за животните International. Всички мишки бяха настанени поотделно в поликарбонатни клетки, имаха свободен достъп до фураж и вода и бяха поддържани при 12-часов цикъл светлина/тъмнина при контролирана температура и влажност.

Модел на мишка за затлъстяване, предизвикано от диета.

Мъжки и женски мишки DBA/2J са получени в търговската мрежа (Jackson Laboratories) на възраст 3 седмици. На възраст 4 седмици женските мишки бяха разпределени на случаен принцип или с високо съдържание на мазнини (45% kcal от свинска мас, n = 60), или с контролна (10% kcal от свинска мас, n = 50) диета (D12451 и D12450B, съответно; Research Diets, Inc.). Диетите са сходни по състав, с изключение на съдържанието на мазнини и въглехидрати ( Допълнителна таблица 1 ) и често се използват за генериране на модел на затлъстяване, предизвикан от диета (22-25). Мишките, хранени с високо съдържание на мазнини, се определят като индуцирано от затлъстяване, след като телесното им тегло е> 2 SD над средното за контролната група, хранена с диета (diet20% по-тежка) (26). Женските мишки се чифтосват и им се позволява да се доставят по естествен път. Мишките са хранени със съответните си диети по време на бременност до деня на лактацията (LD) 5. Приемът на храна и телесното тегло се измерват ежеседмично. Котилата бяха претеглени и броят на малките на едно котило беше преброен в деня на раждането и при LD 5. Проучването беше прекратено по време на ранната лактация поради значителната степен на загуба на котила, настъпила при този модел на затлъстяване, предизвикан от диета.

TNF-инжектирани мишки.

Мишките бяха отглеждани и котилата бяха поддържани на 6 малки/язовир. TNF (R&D системи) се инжектира в MG на лактиращи мишки (n = 5), както е описано по-горе (8, 9).

Клетъчна култура.

Мишки MEC (HC11) са подарък от Джефри Росен (Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас) и са използвани с разрешение на Бернд Гронер (Институт за биомедицински изследвания, Франкфурт, Германия). Клетките се поддържат, както е описано по-горе (9). За да се диференцират HC11 клетки в секреторен фенотип, клетките се култивират в диференцираща среда (безсерумна растежна среда без епидермален растежен фактор, допълнена с 1 μg/ml пролактин и 1 μM кортизол) в продължение на 24 часа при 37 ° C. След диференциация, клетките бяха предварително обработени с цинков сулфат (10 μM) в продължение на 3 часа в растежна среда, последвано от инкубация със или без TNF (15 μg/L) в продължение на 24 часа в безсерумна среда при 37 ° C.

Секрет на мляко.

Секрецията на мляко се измерва при слаби и затлъстели мишки (n = 5–6 мишки/група) на LD 5, използвайки техниката на претегляне на сученето в продължение на 30 минути (27). Мишките бяха убити чрез вдишване на въглероден диоксид и MG бяха фиксирани в 4% фосфатно буфериран параформалдехид за една нощ.

Събиране на мляко и тъкани.

Млякото се изцежда ръчно (п = 6-8 мишки/група) на LD 5 (28). Мишките бяха убити чрез вдишване на въглероден диоксид. Ингвиналните MG са използвани за анализ. MG, използвани за анализ на протеини, бяха замразени върху сух лед и съхранявани при -80 ° C до анализ. MGs, използвани за РНК, се съхраняват в RNAlater (Sigma-Aldrich) при -20 ° C до анализ.

Концентрация на млечен протеин.

Пълномаслено мляко (п = 6-8 мишки/група) се центрофугира при 2000 × g за 15 минути при 4 ° С. Сметановият слой се изстъргва с помощта на връх на пипета и обезмасленото мляко се прехвърля в чиста епруветка. Обезмасленото мляко се разрежда в 2 vol буфер (50 mol/L Na2PO4, 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L EDTA) и се центрофугира два пъти при 11 600 × g за 15 минути при 4 ° C. Концентрацията на протеин в супернатантата се измерва чрез анализ на Брадфорд.

Хистология.

MGs, фиксирани с параформалдехид (n = 3 мишки/група), серийно се дехидратират в етанол, вграждат се в парафин и се разделят (5 μm) върху стъклени стъкла с положително зареждане (28). Секции бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и оценени с помощта на имунохистохимия (28). Секции, оцветени с H&E, бяха използвани за оценка на броя и размера на адипоцитите. Броят на адипоцитите в 3 произволни области под 4-кратно увеличение се отчита и изразява като брой адипоцити/единица площ (mm 2) ± SD. Размерът на адипоцитите беше оценен чрез сравняване на максималния диаметър на адипоцитите от изображения, оцветени с H & E, с помощта на инструмента за владетел във Photoshop. Плъх против мишка F4/80 (макрофагичен маркер, 1: 1000; MCA497; AbD Serotech) е използван за имунооцветяване и е открит с биотинилиран кози анти-плъх IgG (Vector Labs), визуализиран с помощта на ABC Vectastain kit (Vector Labs), и оцветени с толуидиново синьо (EMD). Броят на клетките, които се оцветяват положително за F4/80, се отчита в 3 произволни области под 10-кратно увеличение и се изразява като средна стойност ± SD/единица площ (mm 2). Срезите са изобразени с помощта на Leica DM IL LED микроскоп и софтуер LAS V3.6 (Leica Microsystems).

Относителна RT-PCR в реално време.

MG (п = 7–8 мишки/група) се хомогенизират в TRIzol (Sigma-Aldrich) и се изолира РНК, следвайки инструкциите на производителя (Invitrogen). PCR в реално време се извършва, както е описано по-горе (16). Последователностите на праймера бяха избрани с помощта на Primer3 (Уайтхед Институт за биомедицински изследвания; Допълнителна таблица 2 ), а специфичността е потвърдена чрез оценка на пика на дисоциация с единична температура (данните не са показани). Всяка проба се измерва в два екземпляра и се нормализира до β-актин (Actb). Данните са изразени като сгъване на слабата група (средно ± SD).

Клетъчно фракциониране.

Суровите мембранни протеини (29) и субклетъчните фракции (30) бяха изолирани, както е описано по-горе.

Киселина фосфатазна активност.

Активността на киселинната фосфатаза се използва като индекс на лизозомната активност и автофагията. Активността се измерва с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (CS0740; Sigma-Aldrich), както е описано по-рано (9).

Имуноблотинг.

Статистически анализ.

Резултатите са представени като средни стойности ± SD. Статистическите сравнения бяха извършени с помощта на t-тест на Student (Prism GraphPad). χ 2 -Анализ (точен тест на Фишер) е използван за сравняване на броя на мишките, способни да поддържат лактацията. Повторните мерки ANOVA са използвани за сравняване на приема на храна и телесното тегло. Значителен ефект от диетата е демонстриран в допълнителна таблица P 3 ). Затлъстелите мишки са> 20% по-тежки от мишките, хранени с контролната диета след 5 седмици (допълнителна таблица 3). Степента на зачеване е била с %34% по-ниска (P Допълнителна таблица 4 ). Освен това, значително повече затлъстели язовири (77%) не успяха да отгледат своето потомство след LD 5 в сравнение с слабите майки (39%; P 5, 31, 32), установихме, че затлъстелите мишки показват белези на възпалителна MG микросреда. Теглото на MG при затлъстели лактиращи мишки (0.65 ± 0.06 g) е значително по-високо от теглото на MG при слаби лактиращи мишки (0.47 ± 0.05 g; P 2) в сравнение с слаби лактиращи мишки (772 ± 53.8 адипоцити/mm 2; P = 0.38) Въпреки това, размерът на адипоцитите в MG от затлъстели лактиращи мишки се е увеличил със 100% спрямо адипоцитите на слаби лактиращи мишки (Фигура 1А). Изобилието на макрофаги е значително по-голямо при MG от затлъстели лактиращи мишки (135 ± 40.4 макрофаги/mm 2), отколкото при MG от постни лактиращи мишки (63.8 ± 8.9 макрофага/mm 2; P Фигура 1B). Тези проучвания потвърдиха, че затлъстяването създава провоспалителна микросреда в MG.

Размер на адипоцитите и експресия на иРНК на цитокини в MG от слаби лактиращи и затлъстели лактиращи мишки. (A) Представителни изображения на H & E оцветени секции. Показан е размерът на адипоцитите (скала = 100 μm). (B) експресия на цитокин иРНК. Данните са средно ± SD, n = 8 (постно кърмене) или n = 7 (затлъстяване в периода на кърмене). * Различен от слабите лактиращи мишки, P Фигура 2А). След това измерихме изобилието на ZIP7 и установихме, че ZIP7 е малко по-нисък при MG от затлъстели лактиращи мишки, отколкото при MG от слаби лактиращи мишки (Фигура 2B; P Допълнителна Фигура 1 ) изолирани от MG на затлъстели лактиращи мишки в сравнение с идентични фракции, изолирани от слаби лактиращи мишки (Фигура 2C; P 8, 9). Установихме, че експресията на HSPA5 е потисната в инжектирани с TNF MG в сравнение с инжектирани с физиологичен разтвор MG (Фигура 3А; P Фигура 3B; P Фигура 3C; P Фигура 3D; P = 0.85). Освен това, въпреки че открихме леко намаляване на изобилието на ZIP7 в TNF-стимулирани клетки in vitro, това не беше статистически значимо (Фигура 3Е; P = 0,11). Колективно, това предполага, че сигналът за проинволюция TNF потиска ER стрес и изобилието на ZIP7, но че TNF не е единственият фактор, участващ в увеличаването на ER цинковите пулове по време на инволюцията.

Ефекти на TNF върху маркерите за ER стрес и метаболизма на цинка в сурови лактиращи миши MGs in vivo и диференцирани MECs in vitro. Представителни имуноблоти на протеиново изобилие на HSPA5 в (A) TNF и инжектирани с носител MGs in vivo и (B) HC11 MECs in vitro. (C) Представителен имуноблот на изобилие на протеини на ZIP7 в TNF- и MG, инжектирани с носител. (D) Концентрация на цинк във фракции, обогатени в апарат ER/Golgi, изолирани от MG, инжектирани с TNF и носител. Данните са средни стойности ± SD, n = 5 мишки/група. * P Фигура 4А; P 33) и експресия на v-ATPase (Фигура 4В; P 34) в сравнение с слаби лактиращи мишки. Когато се активира автофагията, протеинът LC3-I, който се намира в цитозола, се липидира и се вкарва в мембраните на автофагозомите като LC3-II (35).

Маркери за лизозомна активност/автофагия и метаболизъм на цинка в MG от слаби лактиращи и затлъстели лактиращи мишки. (A) Данните са средно ± SD, n = 5 мишки/група. * P + -ATPase; ZnT2, цинков транспортер 2.

Маркери за лизозомна активност/автофагия и метаболизъм на цинка в MG от слаби лактиращи и затлъстели лактиращи мишки. (А) Данните са средно ± SD, n = 5 мишки/група. * P + -ATPase; ZnT2, цинков транспортер 2.

В крайна сметка, нашето проучване илюстрира, че по време на лактацията добавеният патофизиологичен ER стрес, свързан със затлъстяването, насочва фенотипа към клетъчна смърт, предразполагащ MG при затлъстели мишки към неуспех на лактацията. Тъй като откриваме повишена лизозомна активност и автофагия, потискането на ER стреса вероятно е резултат от обратна връзка, поради активирането на механизмите за ремоделиране в затлъстялата MG. Важно е, че нашите механистични проучвания осигуряват нова връзка между предизвиканото от затлъстяването възпаление, променените субклетъчни цинкови басейни и активирането на преждевременната инволюция на MG. В съответствие с нашите резултати, други демонстрират, че индуцираното от затлъстяването възпаление на MG се обръща в отговор на ограничението на калориите (47). Бъдещите проучвания трябва да определят дали разрешаването на възпалението преди или по време на бременност е ефективна стратегия за увеличаване на вероятността от успех на лактацията.

Благодарности

VV и SLK замислят проучването; SRH, VV и SLK са проектирали експериментите и са анализирали данните; SRH и VV проведоха експериментите; SRH и SLK са написали ръкописа; SLK имаше основна отговорност за крайното съдържание. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.