Лу Ян

1 Отдел по болести на храносмилателната система, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

Jiaming Zhang

2 Детски микробиомен център в Шандонг, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

Junjie Xu

1 Отдел по болести на храносмилателната система, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

Xuxia Wei

1 Катедра по болести на храносмилателната система, Детска болница Qilu на Университета Шандонг, Дзинан, Китай

Junjie Yang

3 College of Life Science, Qilu Normal University, Jinan, China

Yi Liu

2 Детски микробиомен център в Шандонг, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

4 Изследователски институт по педиатрия, Детска болница Qilu на Университета Шандонг, Дзинан, Китай

Хуа Ли

1 Отдел по болести на храносмилателната система, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

Чанги Джао

2 Детски микробиомен център в Шандонг, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

Ин Уанг

2 Детски микробиомен център в Шандонг, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

4 Изследователски институт по педиатрия, Детска болница Qilu на Университета Шандонг, Дзинан, Китай

Lei Zhang

2 Детски микробиомен център в Шандонг, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

5 Пекински център за напреднали иновации за прецизна медицина, базирана на големи данни, Университет Бейханг, Пекин, Китай

Zhongtao Gai

2 Детски микробиомен център в Шандонг, Детска болница Qilu на университета в Шандонг, Дзинан, Китай

4 Изследователски институт по педиатрия, Детска болница Qilu на Университета Шандонг, Дзинан, Китай

Свързани данни

Всички данни за секвениране, свързани с това проучване, бяха качени в базата данни на NCBI SRA (номер за присъединяване: PRJNA544571). Уеб страницата на базата данни на SRA е https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.

Резюме

Въведение: Инфекцията с хеликобактер пилори постоянно води до хронична и ниска степен на възпалителна реакция в стомашната лигавица и е тясно свързана със стомашно-чревни и извънстомашни заболявания. Ефектите на локалния микробиом върху стомаха са проучени при възрастни и деца с инфекция с H. pylori. Не е известно обаче дали чревната микробна общност се различава при деца с различна инфекция с H. pylori. Целта на това проучване е да се характеризира промененият състав на микробиома, индуциран от инфекция с H. pylori и при гастрит.

Материали и методи: В това проучване са участвали 154 индивида, включително 50 деца, засегнати от гастрит, предизвикан от H. pylori, 42 деца с H. pylori-негативен гастрит и 62 здрави контроли. Съставът на чревния микробиом се анализира, като се използва 16S rRNA генно-базирана пиросеквенция. След това се сравняват фекалното бактериално разнообразие и състав.

Резултати: Въз основа на анализ на приликите и разликите установихме, че децата с индуциран от H. pylori гастрит проявяват дисбиоза на чревните бактерии. Съотношението Firmicutes/Bacteroidetes (F: B) ​​на ниво тип драстично е намаляло в групата с H. pylori-позитивен гастрит (HPG) и групата H. pylori-отрицателен гастрит (HNG), в сравнение със здравата контролна група (HCG) . На ниво семейство и род относителното изобилие на Bacteroidaceae и Enterobacteriaceae е преобладаващо в HPG и HNG, докато относителното изобилие на Lachnospiraceae, Bifidobacteriaceae и Lactobacillaceae се наблюдава в HCG. Разпространението на различни таксони на чревния микробиом в нивата на клас, ред, семейство и род също е наблюдавано сред трите групи.

Заключения: Гастритът може да причини промени в състава на фекалния микробиом, което се влошава от инфекция с H. pylori. Тези промени в чревния микробиом могат да бъдат свързани с лекарствената резистентност и развитието на хронични стомашно-чревни заболявания.

Въведение

Материали и методи

Дизайн на проучването и участници

инфекцията

Блок-схема на това проучване. 210 деца с диспептични симптоми и 64 здрави деца бяха първоначално скринирани за проучването. Деветдесет и пет лица отказаха да дарят фекални проби, а други 15 деца имаха орална анамнеза за наркотици. Всички те бяха изключени. Във втората част на тестовете петима пациенти отказаха да продължат всички тестове, а други трима пациенти със стомашно-чревни язви и/или кървене бяха пропуснати. В групата на здравите деца един фекален образец на детето липсва, а друго дете с анамнеза за перорално приложение е изключено.

Вземане на проби, екстракция на ДНК и секвениране

Фекалните проби се събират със стерилизирани епруветки от 2 ml, съдържащи чист етанол върху лед, незабавно се замразяват (в рамките на 30 минути) и се съхраняват при -80 ° C до анализ. Геномната ДНК се екстрахира с помощта на метод цетил триметиламониев бромид (CTAB) (Wang X. et al., 2018). За количествено определяне на ДНК се използва еквивалент на 1 μl от всяка проба, използвайки NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). За да се анализира бактериалната популация и амплификацията на променливия регион, беше извършен V1 – V2 на гена 16S rRNA. PCR се провежда, като се използват универсални бактериални праймери 27F (5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3 ′) 355R (5′GCTGCCTCCCG TAGGAGT 3 ′). PCR продуктите се проверяват с помощта на електрофореза в 1% (w/v) агарозни гелове в TBE буфер (Tris, борна киселина и EDTA), оцветени с Genecolour I ™ (Gene-bio) и визуализирани под UV светлина. Ампликоните първо се пречистват с помощта на QIA Quick PCR Purification Kit (Qiagen, Барселона, Испания), количествено се определя с помощта на NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) и след това се обединяват в еднаква концентрация. След това обединените ампликони (2 nM) бяха подложени на секвениране, като се използва Illumina HiSeq 2500, следвайки стандартните протоколи на платформата Illumina.

Анализ на 16S rRNA генна последователност

Наборът от сдвоени крайни данни от 16S rRNA генна последователност беше обединен и качествено филтриран, използвайки метода FLASH. Всички анализи на последователността бяха проведени в софтуерния пакет Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME, версия 1.9.1) (Caporaso et al., 2010), съгласно ръководството на QIIME (http://qiime.org/). Химерните последователности бяха премахнати, използвайки usearch61 с de novo модели. Последователностите бяха групирани спрямо базата данни на рибозомните бази данни за зелени гени за 2013 г. (освобождаване 13_8), набор от референтни данни от 97%. Последователностите, които не съответстват на никакви записи в тази препратка, впоследствие бяха групирани в de novo оперативни таксономични единици (OTU) при 97% сходство с UCLUST. Таксономия беше присвоена на всички OTU, използващи класификатора RDP в рамките на QIIME и референтния набор от данни на Greengenes (Cole et al., 2009).

Статистически анализ

Разнообразието на чревния микробиом при три групи деца

Сравнихме богатството (базирано на изобилие оценка на покритието [ACE]) и разнообразието (Шанън) на бактериалната общност между HNG, HPG и HCG (Фигура 2). Няма значителни разлики в индекса на Шанън и АСЕ при сравнението на три групи, с изключение на индекса АСЕ при сравняване на HNG и HCG (P = 0,0042, Фигура 2А).

Сравнение на алфа разнообразието (A, Индекс на Шанън; и Б., ACE индекс) въз основа на OTU профила. HPG, HNG и HCG са оцветени съответно в червено, синьо и зелено. P-стойността се изчислява чрез теста на Wilcoxon rank-sum. HPG, индуцирана от Helicobacter pylori група гастрити; HNG, група H. pylori-отрицателен гастрит; HCG, здрава контролна група; OUT, оперативна таксономична единица.

Също така оценихме бета разнообразието между трите групи, използващи PCoA, въз основа на непретеглените разстояния на UniFrac. PCoA демонстрира групиране на микробни общности между HNG и HPG (Фигура 3A), HCG и HNG (Фигура 3B) и HCG и HPG (Фигура 3C). Използвахме анализ на сходствата (ANOSIM), за да тестваме дали две групи се различават значително при PCoA. Резултатите показват, че има значителна разлика в структурата на микробиома на червата между HNG и HPG (P = 0,002, R = 0,055, ANOSIM), HCG и HNG (P = 0,001, R = 0,178, ANOSIM) и HCG и HPG (P = 0,001, R = 0,187, ANOSIM).

PCoA на бактериално бета разнообразие въз основа на нетегленото разстояние UniFrac. (А) Между HPG и HNG. (Б) Между HNG и HCG. (° С) Между HPG и HCG. PCoA, основен координатен анализ; HPG, индуцирана от Helicobacter pylori група гастрити; HNG, група H. pylori-отрицателен гастрит; HCG, здрава контролна група.

Състав на чревния микробиом на деца от трите групи

Сравнение на относителното изобилие на таксони между HPG, HNG и HCG. (А) Сравнение на относителното разпространение на таксони между HPG, HNG и HCG на ниво филум. (Б) Сравнение на относителното изобилие на таксони между HPG, HNG и HCG на ниво род. (° С) Диаграма на Вен. HPG, индуцирана от Helicobacter pylori група гастрити; HNG, група H. pylori-отрицателен гастрит; HCG, здрава контролна група.

Диференциално таксономично изобилие в три групи деца

Прогнозна функция на чревния микробиом при три групи деца

Прогнозирана метагеномна функция въз основа на анализ на пътя на KEGG. Графиките с разширена лента за грешки показват значително различното изобилие от пътища на KEGG. (А) Между HPG и HNG. (Б) Между HNG и HCG. (° С) Между HPG и HCG. Пропорцията (лявата страна) показва възможното изобилие от микроби, притежаващи всяка функционална характеристика и разликата между пропорциите за всяка характеристика. Кръговете (от дясната страна) представляват разликата между средния дял на бактериите (размера на ефекта), съседни на съответните им CI (ленти за грешки). KEGG, Киото енциклопедия на гени и геноми; HPG, индуцирана от Helicobacter pylori група гастрити; HNG, група H. pylori-отрицателен гастрит; HCG, здрава контролна група.

Дискусии

Микробиомната дисбиоза е свързана със стомашно-чревни заболявания, включително гастрит, при което Helicobacter pylori играе важна роля (He et al., 2016; Minalyan et al., 2017; Sgambato et al., 2017; Gorkiewicz and Moschen, 2018). Въпреки че има няколко проучвания, насочени към бактериалното биоразнообразие в горната част на стомашно-чревния тракт, ролята на инфекцията с H. pylori и гастрит в чревната бактериална общност, особено при деца, е неизвестна. Предварително проучване оценява влиянието на инфекцията с H. pylori и гастрит върху фекалния микробиом чрез сравняване на три педиатрични групи, като се използва анализ на 16S rRNA генна последователност. Това проучване разкри (i) значителни разлики в анализа на бета разнообразието в трите групи, особено в HPG, HNG и HCG; (ii) Съотношението F: B драстично намалява както при HPG, така и при HNG, с по-голямо изобилие от Bacteroidaceae и Enterobacteriaceae и по-ниско изобилие от Lachnospiraceae, Bifidobacteriaceae и Lactobacillaceae, също намерени в HPG и HNG; и (iii) HPG има по-голямо изобилие от Betaproteobacteria, Lactobacillales и Streptococcus, по-ниско изобилие от Alphaproteobacteria, Megasphaera, отколкото HNG. Резултатите показват, че инфекцията с H. pylori и гастритът могат да променят чревния микробиом.

В заключение, фекалният микробиом е бил повлиян от H. pylori при пациенти с гастрит. Сравненията на съставите на чревния микробиом в HPG и HCG също потвърждават горната промяна във фекалния микробиом при гастрит и инфекция с H. pylori. В същото време това също показва, че повечето промени в чревната флора са причинени от стомашна инфекция. Въпреки това, фактори, причинени от инфекция с H. pylori, също могат да причинят промени в количеството на някои специални бактерии. Стрептококи и Megasphaera са открити в изобилие в HPG и HNG. Това е в съответствие със симптомите на лошо храносмилане, наблюдавани при пациенти с гастрит, индуциран от H. pylori и често срещан гастрит (Correa Silva et al., 2016; Jones et al., 2017).

В заключение, това проучване за първи път демонстрира структурната, композиционната и функционалната дисбиоза на фекалния микробиом при гастрит, причинен от H. pylori. Той посочи, че настоящото лечение, комбинирано със стратегии, които модулират чревния микробиом, може да подобри клиничния резултат от гастрит, индуциран от H. pylori. Констатациите могат да проправят пътя за започване на клинични валидации с по-голяма група и разработване на насоки за терапевтични стратегии с пробиотици. Изследването обаче има и някои недостатъци; например, технологията е точна само за няколко вида и съответните проби от стомашна лигавица и кръвни проби на индивиди не са събрани за сравнение със същия фекален образец. Освен това броят на ангажираните деца е по-малък. В бъдеще е необходимо по-голямо проучване и трябва да бъдат събрани подробни клинични данни, за да се потвърдят тези резултати.

Декларация за наличност на данни

Всички данни за секвениране, свързани с това проучване, бяха качени в базата данни на NCBI SRA (номер за присъединяване: PRJNA544571). Уеб страницата на базата данни на SRA е https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.

Декларация за етика

Проучванията, включващи човешки участници, бяха разгледани и одобрени от Комитета по медицинска етика на детската болница Qilu от университета в Шандонг. Писмено информирано съгласие за участие в това проучване е предоставено от законния настойник на участниците/близки роднини.