Съобщено от Роланд Дус, Университет в Гренобъл, Гренобъл, Франция

s-локусна

Експресия на рекомбинантни SRK3 протеини в клетки на насекоми. (А) Схематично представяне на трите рекомбинантни SRK протеина, SRK3HA, SRK3His и m SRK3His. Показва се позицията на различните епитопи и тагове. N и C краищата на рекомбинантните протеини са съответно вляво и вдясно. Белият правоъгълник представлява S-домейн (S), черната вертикална лента обхващащ мембраната (tm) домейн, излюпеният правоъгълник обозначава цитоплазмения домейн (kin), а светлите и тъмносивите набраздени правоъгълници показват HA епитоп и хексахистидинов маркер, съответно. Посочени са епитопи, разпознати от различни антитела и мястото на свързване на Ni-NTA. Заместването на Lys-553 с аргинин (K-> R) в m SRK3His конструкцията е обозначено с вертикална стрелка. (Б) Имуноблотинг на SRK рекомбинантни протеини. Протеини, извлечени от Sf21 клетки, заразени от родителския бакуловирус (C) (пътища 1 и 3) или от Sf21 клетки, заразени с бакуловирус, задвижващи експресията на SRK3HA (HA) (пътища 2, 4, 6 и 7) или SRK3His (His) (платна 5 и 8) бяха разделени чрез SDS/PAGE и електроблотирани. В някои случаи електрофорезата се предшества от пречистване с Ni-NTA агарозни зърна, както е посочено.

Рекомбинантни SRK автофосфорилати върху серинови и треонинови остатъци в мембранна среда. (А) Микрозоми от неинфектирани Sf21 клетки (C) или от Sf21 клетки, експресиращи SRK3HA (HA), SRK3His (His) или дефектна киназа m SRK3His (m His) бяха радиомаркирани с [γ- 32 P] ATP. В някои случаи протеините (пътища 4 и 5) се пречистват върху Ni-NTA агарозни зърна след радиомаркиране. Протеините се разделят чрез SDS/PAGE и се откриват чрез авторадиография. (В) Радиомаркиран SRK3His се пречиства върху Ni-NTA агарозни зърна и се хидролизира. Свободните аминокиселини се разделят в две измерения чрез хроматография и електрофореза, както е посочено, и радиоактивно маркирани аминокиселини се откриват чрез авторадиография. Фосфоаминокиселините (P-ser, P-thr и P-tyr за фосфосерин, фосфотреонин и фосфотирозин, съответно) се позиционират чрез оцветяване на нерадиомаркирани фосфоаминокиселини, добавени преди разделяне, с нихидрин. Pi показва неорганичен фосфат.

Междумолекулно фосфорилиране на рекомбинантни SRK протеини. Микрозомите от Sf21 клетки, експресиращи или SRK3HA (HA), или дефектна на киназа m SRK3His (m His), или от клетки Sf21, коекспресиращи m SRK3His и SRK3HA (m His + HA), бяха радиомаркирани и протеините, носещи хексахистидиновия маркер, бяха пречистени на Ni-NTA агарозни мъниста. За пробата, показана в линия 4, се добавят екстракти от немаркирани микрозоми от клетки, експресиращи m SRK3His, преди пречистване върху Ni-NTA агарозни зърна. Протеини, елуирани от Ni-NTA агарозни зърна, бяха разделени чрез SDS/PAGE и анализирани чрез авторадиография. Пресеченият рекомбинантен SRK3 и замърсяващите полипептиди са обозначени със сиви върхове на стрелките, а фосфорилираният SRK е обозначен със стрелка.

Идентифициране на SRK олигомерни комплекси в екстракт от стигма. (А) Протеините бяха извлечени от стигми, експресиращи S3 хаплотипа в буфер, съдържащ Triton X-100 и третирани (+) или не (-) с омрежващ реагент глутаралдехид. След това протеините се разделят чрез SDS/PAGE и се имуноблотират с mAb 85-36-71. Съдържащите SRK3 комплекси от 161 и 233 kDa са обозначени със стрелки. Мономерните SRK3 и eSRK3 са обозначени съответно със звездичка и стрелка. (Б) Скоростно утаяване върху градиенти на захарозата. Протеините се екстрахират в буфер, съдържащ октил-глюкозид и стигматичните екстракти се допълват с SDS при концентрация от 0,5% (маса/обем) (+ SDS) или не (-SDS). Присъствието на SRK3 (SRK), eSRK3 (eSRK) и SLG3 (SLG) в различните фракции беше изследвано чрез имуноблотинг с mAb 85-36-71 и анти-SLG3 антитела. Разпределението на маркери за молекулна маса (66, 150 и 200 kDa) е посочено в долната част на всеки панел.

Два модела за молекулярния механизъм на предаване на сигнала чрез SRK в отговор на SI. (А) Този модел предполага, че SRK (отворен правоъгълник) спонтанно се асоциира като димер в плазмалемата на стигматичните папиларни клетки преди опрашването. Взаимодействието със самостоятелно поленов лиганд (запълнен кръг) предизвиква конформационна промяна на SRK, което позволява набирането на цитоплазмени мишени (големи излюпени кръгове), които медиират SI реакцията. В примера, показан тук, цитоплазмените мишени разпознават фосфорилирани остатъци (малки кръгове) върху SRK протеина. (B) Във втория модел SRK също присъства като конститутивно образуван димер, но активирането на SI реакция от поленов лиганд (в черно) изисква както свързване към SRK по специфичен за алела начин, така и след това свързване с втори като все още неизвестен корецептор (излюпен правоъгълник), който не трябва да проявява алелна специфичност. Предаването на сигнала тогава може да включва взаимодействие на втория рецептор с цитозолни мишени, аналогични на описаните за серин/треонин рецептор кинази при животни.