Устойчива хиперлептинемия от 8 ng/ml се предизвиква в продължение на 28 дни при нормални плъхове Wistar чрез инфузия на рекомбинантен аденовирус, съдържащ кДНК на плъхов лептин (AdCMV-лептин). Хиперлептинемичните плъхове показват 30-50% намаление на приема на храна и печелят само 22 g за експерименталния период спрямо 115-132 g при контролни животни, които са получавали инфузии с физиологичен разтвор или рекомбинантен вирус, съдържащ гена на β-галактозидаза (AdCMV-βGal). Липсва телесна мазнина при плъхове с хиперлептинемия, докато контролните плъхове, хранени по двойки с хиперлептинемичните плъхове, запазват ≈50% телесни мазнини. Освен това плазмените триглицериди и инсулиновите нива са били значително по-ниски при хиперлептинемични спрямо контролирани с двойки, докато нивата на мастна киселина и глюкоза са били сходни в двете групи, което предполага повишена чувствителност към инсулин при хиперлептинемичните животни. По този начин, въпреки еквивалентното намаляване на приема на храна и наддаването на тегло при хиперлептинемични животни и животни, хранени по двойки, идентифицируемата мастна тъкан е напълно аблация само в предишната група, което увеличава възможността за специфична липоатрофична активност за лептин.

нормални

Затлъстяването на ob/ob мишки е резултат от лептинов дефицит, причинен от мутация в ob гена (1), и реагира драстично на инжекционната терапия с рекомбинантен лептин, прилаган интраперитонеално (2–4). При нормални слаби плъхове ефектът от високите нива на лептин е по-малко ясен; съобщава се, че големи дози от хормона намаляват приема на храна и телесното тегло, но ефектът е по-малко поразителен, отколкото при мишки с дефицит на лептин ob/ob (2, 4).

За да се получи по-пълна оценка на ефектите от хроничната хиперлептинемия при нормални животни, ние изследвахме приема на храна и телесното тегло при нормални плъхове, при които продължително 6- до 10-кратно повишаване на нивата на лептин в плазмата се индуцира от рекомбинантно аденовирусно медиирано доставяне . При хиперлептинемични плъхове, изследвани в продължение на 28 дни, наблюдаваме 30% намаляване на приема на храна и виртуално спиране на наддаването на телесно тегло, придружено от изчезване на грубо идентифицируемата мастна тъкан. За разлика от това, само частично намаляване на мастните депа се наблюдава при контролирани с двойки, въпреки подобна степен на загуба на тегло.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Клониране на лептин от плъх и измерване на неговата експресия чрез обратна транскриптаза – PCR.

Общата РНК се приготвя от 1 g епидидимална мастна тъкан (за клониране на cDNA) или от 0,5 g черен дроб (за измерване на експресията на лептин) на плъхове чрез екстракция с TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD), следвайки протокола на производителя. Oligo-dT се използва за първоначално синтезиране на cDNA от първа верига, като се използва комплект за синтез на cDNA (CLONTECH). След третиране на първата верига cDNA с без-ДНКаза RNase, генетичният продукт на лептина се амплифицира чрез PCR, като се използва праймер за смисъл 5′-GGAGGAATCCCTGCTCCAGC-3 ′ и антисенс праймер 5′-CTTCTCCTGAGGATACCTGG-3 ′, базиран на гена на лептин от плъх последователност (5). Както за клониране на cDNA, така и за измерване на mRNA на лептин, амплификацията беше извършена, като се използва един цикъл при 94 ° C за 3 минути, последван от 35 цикъла при 92 ° C за 45 sec, 54 ° C за 45 sec и 72 ° C за 1 min, и след това окончателно удължаване при 70 ° С за 10 минути. Като контрол за качеството на РНК, ние също измерихме експресията на β-актин, използвайки същите условия на усилване като за лептин и описана по-рано олигонуклеотидна двойка (6).

Получаване на рекомбинантен аденовирус.

640-bp PCR фрагмент, съдържащ цялата кодираща област на лептин, се лигира към pCR TM 2.1 (Invitrogen), съгласно протокола на производителя. Анализът на последователността потвърди, че няколко клонинги съдържат непокътнатата лептинова кДНК. BamHI- и XbaI-рестриктиран лептинов cDNA фрагмент, който включва 60 bp от 5'-нетранслиран регион и 76 bp от 3'-нетранслиран регион, е лигиран към подобно третиран pACCMVpLpA (7). Полученият плазмид е котрансфектиран с pJM17 (8) в 293 клетки чрез калциев фосфат/ДНК копреципитация за генериране на новия рекомбинантен вирус, наречен AdCMV-лептин, като се използват описаните по-рано методи (9). ДНК на вируса се изолира и присъствието на лептиновия ген вложка се потвърждава чрез PCR, като се използват праймерите, описани по-горе, и чрез Southern blot с олигонуклеотид (5′-CGGATACCGACTGCGTGTGTGAAATGTCAT-3 '), комплементарен на кДНК на лептин от плъх. Запасите от AdCMV-лептин се усилват и пречистват, както е описано (9), и се съхраняват при -70 ° C в PBS с 0,2% BSA и 10% глицерол при 1-3 × 10 12 образуващи плака единици/ml. Вирус, съдържащ бактериалния β-галактозидазен ген под контрола на промотора на цитомегаловирус (AdCMV-βGal), беше приготвен и използван, както е описано по-горе (10).

Клетъчна култура.

293 клетки на човешки ембрионален бъбрек се размножават в 60-милиметрови (за котрансфекция) или 150-милиметрови (за усилване на вирусни запаси) културни ястия в модифицираната среда на Dulbecco Eagle's (DMEM), допълнена с 10% фетален говежди серум, 100 единици пеницилин на ml и 10 μg стрептомицин на ml при 37 ° C/5% CO2. Всички компоненти на средата бяха от GIBCO/BRL.

Животни.

Мъжки плъхове Wistar са получени от лаборатории за развъждане на Charles River. Преди проучвания за инфузия на аденовирус, всички плъхове са получавали стандартно чау чау (Teklad F6 8664; Teklad, Madison, WI) ad libitum и са имали свободен достъп до вода. „Хранените по двойки“ животни са получавали същото количество храна, каквото е поглъщано ежедневно от AdCMV-лептинови животни в експериментите, показани на фиг. 2А.

Плазмен лептин, прием на храна и телесно тегло. Нивата на плазмен лептин (A), приемът на храна (B) и телесното тегло (C) са измерени при плъхове Wistar, които са получавали инфузии на AdCMV-лептин, AdCMV-βGal или физиологичен разтвор, и при плъхове Wistar, хранени с AdCMV-лептин -инфузирани плъхове. Стойностите представляват средна стойност ± SEM за четири животни от всяка група.

Вирусна инфузия при нормални плъхове Wistar.

Полиетиленовите тръби (PE-50; Becton Dickinson) бяха закотвени в лявата каротидна артерия на 9-седмични плъхове Wistar от ≈250-300 g под анестезия на натриева пентобарбитална (50 mg/kg; Abbott) и екстериоризирани през подкожен тунел. Животните бяха поставени в яке и тръбите бяха свързани към връв и вирбел (Harvard Bioscience, South Natick, MA). Тръбите бяха пълни с хепаринизиран физиологичен разтвор (1000 единици/dl), докато инфузията на вируса не започне 3 дни след операцията. Преди инфузия пробите от аденовирус се суспендират във физиологичен разтвор и се филтрират през 0.2-μm филтър. Два милилитра AdCMV-лептин или AdCMV-βGal, съдържащи общо 1 × 10 12 единици, образуващи плаки, или като втора контрола, 2 ml физиологичен разтвор, се вливат в съзнателни животни за период от 10 минути. Животните са изследвани в отделни метаболитни клетки (Nalgene) и приемът на храна и телесното тегло се измерват ежедневно.

Измервания на плазмата.

Кръвни проби се събират от опашната вена в капилярни тръби, покрити с EDTA, на седмични интервали, започващи 72 часа след инфузия на аденовирус. Плазмата се съхранява при -20 ° C до момента на анализ на лептина. Плазменият лептин се анализира с помощта на комплекта за анализ на лептин на Linco (Linco Research Immunoassay, St. Charles, MO). Плазменият инсулин се изследва по стандартни методи. Свободните мастни киселини (FFA) бяха измерени с комплект съгласно препоръките на производителя (Boehringer Mannheim).

Подготовка на тъканите.

Всички животни бяха умъртвени под натриева пентобарбитална анестезия. Тъканите се дисектират незабавно, измиват се със стерилизиран и охладен с лед 10 mM физиологичен разтвор на фосфатен буфер и се замразяват в течен азот. Тъканите се държат при -70 ° C до екстракция на РНК.

Морфология.

Фиксираните от Bouin's парафинови серийни секции на перфузирани панкреати бяха оцветени с хематоксилин/еозин и изследвани със светлинна микроскопия.

РЕЗУЛТАТИ

Leptin mRNA Нива в черния дроб.

Предишни проучвания с рекомбинантни аденовируси, прилагани на непокътнати гризачи, показват, че> 99% от експресията на репортерния ген се намира в черния дроб (10). Въз основа на това откритие, ние изследвахме експресията на лептинов ген в чернодробни проби от нормални 9-седмични плъхове Wistar, които получиха чрез интравенозен катетър инфузия или на AdCMV-лептинов вирус, или, като контрол, на AdCMV-βGal вирус, съдържащ ген за бактериална β-галактозидаза. Двадесет и осем дни след вливане на вируса, mRNA с лептин не се открива при третирани с AdCMV-βGal животни, но е силно изразена в проби от плъхове, лекувани с AdCMV-лептин (Фиг. 1). По този начин лептиновият трансген се изразява ефективно в черния дроб и тази тъкан е вероятното място за производство на лептин в изследванията, които следват.

Експресия на лептин мРНК в черния дроб. Плъховете бяха инфузирани с рекомбинантни аденовируси, съдържащи кДНК на плъх лептин (AdCMV-лептин) или гена β-галактозидаза (AdCMV-βGal). Чернодробни проби се събират на 28 дни след вирусна инфузия и се подлагат на обратна транскриптаза-PCR анализ на експресия на лептин и β-актин иРНК. ИРНК на лептин се открива само в чернодробни проби от животни, лекувани с AdCMV-лептин.

Нива на плазмен лептин.

Средното ниво на плазмен лептин при животни, лекувани с AdCMV-βGal, и животни, вложени с физиологичен разтвор, са средно съответно 0,8 ± 0,2 и 1,5 ± 0,2 ng/ml. За разлика от това при лекуваните с AdCMV лептин плъхове средното ниво на плазмен лептин се повишава в рамките на 3 дни до 8 ± 0,4 ng/ml и остава на или близо до това ниво през 28-те дни на наблюдение (Фиг. 2А).

Ефекти от първичната хиперлептинемия върху приема на храна и телесното тегло.

Външен вид на тялото и отсъствие на мастни депа при хиперлептинемични плъхове. Цялостният външен вид на тялото (Горна част) и епидидималната мастна тъкан при дисектирани животни (Долна) се сравняват при плъхове с инсулин с физиологичен разтвор (контрол), AdCMV-лептин и AdCMV-βGaL и при плъхове, хранени с двойки на лекувани с AdCMV-лептин животни . Епидидималните депа за мазнини се идентифицират със стрелки (Долна). Снимките са представителни за резултатите при четири животни на група.

Плазмени нива на глюкоза, инсулин и FFA.

Известно е, че повишените нива на FFA причиняват инсулинова резистентност (11–14) и стимулират секрецията на инсулин (15). Тъй като изчезването на мастна тъкан при хиперлептинемични плъхове елиминира основния източник на плазмен FFA, ние сравнихме плазмените FFA, глюкозата и нивата на инсулин в различните групи в кръвни проби, получени от опашната вена между 1200 и 1400 часа. Двадесет и осем дни след вливане на AdCMV-βGal или физиологичен разтвор, нивата на FFA са средно съответно 0,75 ± 0,1 и 0,80 ± 0,1 mM. Плазмените триглицериди (TG) в тези групи са средно съответно 111 ± 21 и 101 ± 9 mg/dl. При хиперлептинемични плъхове, след изчезване на телесните мазнини, FFA е средно 0,34 ± 0,03 mM, а TG е средно 29 ± 4 mg/dl. При двойно хранени хиполептинемични плъхове FFA е средно 0,38 ± 0,03 mM, а TG е средно 58 ± 12 mg/dl. Нивата на кръвната захар са били нормални във всички групи. Плазменият инсулин, който е бил средно 28 ± 4 microunits/ml преди хиперлептинемията, измерва 8,4 ± 1 microunits/ml на 28 дни, вероятно отразяващ по-голяма чувствителност на прицелните тъкани към действието на инсулина. Нивата на инсулин бяха намалени до по-малка степен при контролираните с двойки контроли (18,4 ± 6,0 microunits/ml). Тези резултати са обобщени в таблица 1.

Плазмени нива на TG, FFA, глюкоза и инсулин в AdCMV-лептин и AdCMV-βGal плъхове Wistar преди и след инфузията на вируса, в контролирани инфузии с физиологичен разтвор и при нормални плъхове, хранени с AdCMV-лептин плъхове

Морфология на панкреаса.

Намаляването на плазмения инсулин при хиперлептинемични плъхове може да отразява или подобрено инсулиново действие поради ниските нива на FFA или увреждане на β-клетки, причинено от изразената хиперлептинемия. Инспекция на островчета в участъци на панкреаса, оцветени с хематоксилин/еозин, взети от AdCMV-инфузиран с лептин или контролни плъхове, не разкри морфологични разлики.

ДИСКУСИЯ

В настоящото проучване ние използвахме рекомбинантна аденовирусна технология, за да демонстрираме ефектите от хиперлептинемията при нормални животни. Докато констатацията, че повишените нива на циркулиращ лептин водят до намален прием на храна и наддаване на телесно тегло в сравнение с нормолептинемичния контрол, е в съответствие с предишната работа (2–4), степента на ефекта е неочаквана и не може да се отдаде на ефектите от понижената храна прием самостоятелно. Налице е пълно изчезване на видими телесни мазнини при AdCMV-лептинови животни, находка, която не е достигната при животни, хранени по двойки с хиперлептинемичната група.

Предполага се, че тази разлика е резултат от термогенния ефект на хиперлептинемията (3), но увеличава възможността за специфичен ефект на нерегулираната хиперлептинемия върху съхранението на мазнини в адипоцитите. В допълнение, докато нивата на FFA са намалени по подобен начин при хиперлептинемични животни и животни, хранени по двойки, спрямо двете контролни групи (AdCMV-βGal- или инфузирани с физиологичен разтвор) и нивата на глюкоза остават нормални при всички животни, хиперлептинемичните животни показват значително по-нисък плазмен инсулин и Нива на TG в сравнение с животни, хранени по двойки, или контроли Тези резултати подкрепят мнението, че относителната устойчивост на мастните депа към терапевтично ограничаване на приема на храна при затлъстяване при хора може да бъде подобрена чрез заместване с лептин, както беше предложено по-рано (1).

Ниските TG и FFA при хиперлептинемични плъхове са свързани с доказателства за повишена инсулинова чувствителност, проявяваща се с нормалните нива на глюкоза в кръвта въпреки 60% намаление на плазмените нива на инсулин. По-умереното намаляване на TG при контролирани с двойки и задържането на ≈50% от нормалните депа на мазнини е свързано с много по-малко намаляване на нивата на инсулин от наблюдаваното при хиперлептинемични плъхове. Тези данни предполагат, че инсулиновата чувствителност е свързана с нивото на тъканните мазнини и са в съответствие с широко разпространеното мнение, че повишената FFA на тъканите пречи на метаболизма на глюкозата (11-14) и увеличава секрецията на инсулин (15, 16). В това проучване не е обяснен механизмът, чрез който FFA на плазмата при „липоатрофичните“ хиперлептинемични плъхове се поддържа на същото ниво като при контролите с двойно хранене. Може би това отразява висока степен на липолиза в остатъчни адипоцити, които все още не са изпразнени изцяло от мазнини.

Благодарности

Благодарим на д-р. Даниел Фостър, Скот Грунди и Дж. Денис Макгари за критично четене на ръкописа и Кей МакКоркъл, Дона Леман и Фалгуни Триу за изключителна техническа подкрепа. Дорис Химелрик, Кей Натън и Сюзън Кенеди оказаха секретарска помощ. Тази работа беше подкрепена от Националните здравни институти за безвъзмездна помощ DK02700-37 и P50H2598801, Национална институция по здравеопазване/Фонд за младежки диабет, Програма за интердисциплинарна изследователска програма за диабет и Отдел за институционална подкрепа за научни изследвания от Министерството на ветераните SMI 821–109. R.O. се подкрепя от стипендия на Американско физиологично общество/Genentech Inc.

Бележки под линия

Whom Към кого трябва да бъдат отправени искания за повторно отпечатване: Gifford Laboratories for Diabetes Research, стая Y8.212, Югозападен медицински център на Тексаския университет в Далас, булевард „Хари Хайнс“ 5323, Далас, Тексас 75235-8854.

Съкращения: FFA, свободни мастни киселини; TG, триглицериди.