Ефект на олигоуронатите върху свойствата на Matrigel

използване

Използва се Matrigel (BD Biosciences), както е получено от производителя. Тестваният G-блок (dp 10, филтриран с въглен) се разтваря при 10 mg/ml във физиологичен разтвор (150 mM NaCl). Разтворът на G-блока и физиологичният физиологичен разтвор бяха охладени върху лед, а решетката на Ependorf и пипетата бяха охладени. Matrigel (4 × Ependorf, съдържащ 100 μl) се размразява върху лед.

Като контрола, 100 μl физиологичен разтвор бяха добавени към всеки от 2 Matrigel Ependorfs и пипетирани нагоре и надолу, за да се постигне пълно смесване. Съдържанието на 2-те епруветки се смесва и съхранява върху лед.

За да се тества G-блокът, 100 μl разтвор на G-блок бяха добавени към всеки от 2 Matrigel Ependorfs и пипетирани нагоре и надолу, за да се постигне пълно смесване. Съдържанието на двете епруветки се смесва и се съхранява върху лед.

300 μl от контролния или тестов разтвор на Matrigel се нанасят върху реометрични плочи при 10 ° С (като се използва геометрия C 40/1) за реологични измервания. Комплексният модул (G * в Pa) се измерва при температурен размах от 10-37 ° C ., ½ ° минута -1. G * е показателно за механичните свойства на изпитвания материал. Резултатите са показани на фиг. 1.

Експериментът беше повторен, включително други олигоуронати: контрол (както по-горе), G-блок10 (Dp 10, 94% G: 5 mg/ml), G-блок20 (Dp 20, 90% G; 5 mg/mi), M- блок (Dp 20, 100% M; 5 mg/ml) и олигомер на галактуронат (не е напълно анализиран, но се смята, че има Dp в диапазона 10-20 и повече от 80% галактуронат (GaIU); 5 mg/ml). Резултатите са показани на фиг. 2.

В експеримента са изследвани само кинетиката на образуване на гел, а не равновесни свойства. Въпреки това от тези фигури може да се види, че олигоуронатите, по-специално алгинатните олигомери и особено олигомерите на G-блока (олигогулуронати) са имали ефект върху реологията на препарата на матригел ECM и по-специално са ефективни при намаляване на G *. Това ясно показва, че структурата е засегната (нарушена) и подобреното твърдо поведение на ECM е намалено. С други думи, олигоруронатите намаляват желирането или гелоподобното поведение на ECM.

Ефект на G-блока или самостоятелно, или в комбинация с гемцитабин в модела на ксенографт на тумор на панкреаса Capan-2 при човека

Целта на това проучване е да се оцени антитуморната активност на G-Block като подобрител в комбинация с гемцитабин в модела на ксенографт на тумор на панкреаса на Capan-2 при човека. Гемцитабин е дозиран на ниво, което няма да бъде лечебно и позволява да се докаже оценка на концепцията в този модел. Ефикасността е оценена чрез сравняване на теглото на тумора на третирани групи с контролната група на носителя на Ден 11 и 74 и между групите комбинации и съответните им единични агенти на Ден 11 и 74.

Материали и методи

G-Block (Lot #PolyG 230712-Dp10, 95% G) се получава като бял хигроскопичен аморфен прах от NTNU Technology Transfer AS (Трондхайм, Норвегия) и се съхранява изсушен при стайна температура до употреба. G-блокът на NTNU се разтваря във вода MilliQ до концентрация 70 mg/ml, за да се използва като основен разтвор. Този разтвор се използва за доставяне на доза от приблизително 560 mg/kg във фиксирана доза от 200 μl. След това разтворът от 70 mg/ml се разрежда в 0,9% 150 mM NaCl (B. Braun Medical; Irvine, Калифорния), за да се доставят дози от приблизително 200 mg/kg, 75 mg/kg, 25 mg/kg и 5 mg/kg в 200 μL фиксиран обем на дозата. Всички изчисления за дозиране предполагат 25 g животно. Основният разтвор на G-Block 70 mg/ml на NTNU беше формулиран в началото на изследването и използван за разреждания преди всяка доза, стерилно филтриран и съхраняван при 4 ° С между дозите. Цялата неизползвана дозираща смес беше изхвърлена правилно при TD2 след приключване на проучването.

Гемцитабин (партида № A892259C) се получава като разтвор от Eli Lilly and Co. (Indianapolis, Ind.) И се съхранява при стайна температура до употреба. Гемцитабинът се разрежда във физиологичен разтвор (B. Braun Medical; Irvine, Калифорния) до концентрация от 0,5 mg/ml, за да се достави доза от 5,0 mg/kg в обем на доза от 10 ml/kg. Гемцитабин е формулиран в прясно състояние преди всяка доза. Цялата неизползвана дозираща смес се изхвърля правилно при TD2 след всяка доза.

Контролът на превозното средство се дозира с разтвор от 0,9% 150 mM NaCl при доза от 10 ml/kg. Контролът на превозното средство се съхранява при стайна температура.

Клетъчната линия на ксенотрансплантата на тумор на панкреас на човешкия панкреас се получава от ATCC (Manassas, Va.). Културите се поддържат в среда 5A на McCoy (Hyclone, Logan, Utah), допълнена с 10% фетален говежди серум (Omega Scientific; Tarzana, Калифорния) и се помещават в 5% CO2 атмосфера. Културите се разширяват в колби за тъканни култури при съотношение на разделяне 1: 5, докато се събират достатъчно количество клетки.

Женски мишки от Athymic Nude (Hsd: Athymic Nude-Foxn1 nu) са доставени от Harlan (Germantown, NY). Мишките бяха приети на 4 седмична възраст. Всички мишки бяха аклиматизирани преди обработка. Мишките бяха настанени в клетки с микроизолатор (Lab Products, Seaford, Del.) И поддържани при специфични условия, свободни от патогени. Мишките бяха хранени с облъчена с лабораторна диета Tekland Global Diet® 2920 × (Harlan, Indianapolis, Ind.) И вода в автоклави беше свободно достъпна. Всички процедури бяха проведени съгласно институционалните насоки на институционалния комитет за грижа и употреба на животните на TGen (Протокол № 13046).

Женските мишки бяха инокулирани подкожно в десния фланг с 0,1 ml 50% RPMI/50% Matrigel ™ (BD Biosciences, Bedford, Масачузетс), съдържаща суспензия от туморни клетки Capan-2 (приблизително 5,0 × 106 клетки/мишка ). Седем дни след инокулация, туморите се измерват с помощта на дебеломери и теглото на тумора се изчислява с помощта на софтуера за управление на изследването върху животни, Директор на изследването V.2.1.1 (Log Log) Осемдесет мишки с размери на тумора от 101-194 mg бяха рандомизирани в осем групи от по десет мишки, всяка чрез произволно уравновесяване със средно приблизително 140 mg, като се използва Директор на изследването (Ден 1). Теглото на тялото се записва, когато мишките се рандомизират и се вземат два пъти седмично след това заедно с измерванията на тумора. Дозирането се извършва, както е описано по-долу в таблица 1.

Всички групи бяха прекратени на ден 74. Мишките бяха умъртвени преди края на изследването, ако теглото на тумора надвишава 1500 mg. При аутопсия, туморите бяха изрязани от всички животни във всички групи и разделени наполовина, поставени във флакони с формалин (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, NJ), след което фиксирани за около 24 часа, преди да се прехвърлят в етанол. Фиксираните с формалин тъкани бяха вградени в парафин, обработени и оцветени с H & E.

Всички лекувани групи показват нарастващо телесно тегло след първите няколко дни от проучването, което показва, че режимът на лечение се понася добре. Незначителна туморна некроза се наблюдава при някои мишки. Една мишка (Група 2 Мишка 10) е имала нетипични клинични наблюдения, включващи дискоидни папули и маси по кожата. Това наблюдение не е определено като свързано с лечението.

Резултатите са обобщени на ФИГ. 3 (А и В) и 4. Както е показано на фигурите, изненадващо, като единичен агент G-блок води до по-ниски средни тегла на тумора в сравнение с контрола на носителя в края на фазата на дозиране. Всички комбинирани лечения с G-блок и гемцитабин водят до значително намаляване на средното тегло на тумора в сравнение с контрола на носителя в края на фазата на дозиране. Намаляване на средното тегло на тумора може да се наблюдава в сравнение с отделните агенти, и по-специално само гемцитабин.

По-долу се отнася до статистически анализ на теглото на тумора в изследването, отчетено в пример 2. Това е предклинично проучване, при което 10 мишки са разпределени на осем различни лечения с Vehicle (плацебо), G-Block 560 mg (подобрител), Gemcitabine 5 mg (онкологично лекарство) или комбинацията от Gemcitabine 5 mg с G-Block 5 mg, 25 mg, 75 mg, 200 mg или 560 mg. Теглото на тумора и телесното тегло бяха оценени на ден 1 и след това два пъти седмично до последната оценка на ден 74.

Тегло на тумора - анализ по дни

Анализ на AUC

За да се получи комбинирана мярка във времето, се изчислява площта под кривата (AUC) за тегло на тумора. Различните AUC се изчисляват през интервалите от време 0-60 дни, 0-50 дни, 0-39 дни и 0-29 дни. Стойностите бяха допълнително изразени като средно тегло на тумора (Eav) през интервалите чрез разделяне на AUC с дължината на интервала.

Таблица 3 обобщава резултатите от базален ANOVA анализ за всеки изчислен параметър Eav. Статистически значими ефекти спрямо превозно средство могат да бъдат показани за комбинациите (всички дози G-Block) за всички интервали до 60 дни, за Gemcitabine 5 mg за интервали до 50 дни и за G-Block за интервали до 39 дни. Както се вижда при анализ на отделни дни, остатъчното стандартно отклонение се увеличава с увеличаване на дължината на включения интервал от деня.

С течение на времето теглото на тумора се увеличава, както и остатъчната променливост в моделите ANOVA. Таблица 4 обобщава резултатите от съответните ANOVA модели въз основа на регистрирани данни за теглото на тумора в опит да стабилизира дисперсията. Тези мултипликативни модели дават геометрични средни стойности, тъй като оценките и разликите между лечебните групи ще бъдат изразени като съотношения на такива геометрични средни стойности. Очакваните съотношения спрямо превозно средство с 95% доверителни интервали са илюстрирани на ФИГ. 8. Променливостта, изразена като CV, все още показва нарастваща тенденция, така че трансформацията (лог-аритмиране) не е успяла да я стабилизира напълно. По отношение на статистически значимите ефекти (спрямо превозно средство) резултатите са много подобни на резултатите от съответните анализи на добавките.

Моделен подход

Изследване на кривите на средната стойност на ФИГ. 6 приближение с експоненциални функции изглежда добре се вписва в данните за средната стойност. По този начин модел,

като C е константа (общото изходно тегло на тумора), при скоростта на растеж на тумора за лечение i и t времето за изследване (ден номер -1), е съобразено с данните. При моделирането са използвани само данни до 60 дни.

Получените експоненциални криви са показани на фиг. 9 (черни криви) заедно с отделните криви (тънки червени криви) и наблюдаваните криви на средната стойност (сини криви). За всички активни лечения двата типа криви са много сходни. Лечението с превозни средства обаче показва известно несъответствие, тъй като теглото на тумора средно тук нараства повече от експоненциално в началото и след това се забавя. Това се задвижва от трите мишки с много бърз туморен растеж, наблюдаван на ФИГ. 9. От друга страна, някои мишки, на които е дадено Vehicle, не показват почти никакво нарастване на теглото на тумора, така че експоненциалните нараствания се вписват приемливо, за да представят средно поведение в групата.

Фиг. 10 показва 8 монтирани експоненциални криви. Поради тяхната конструкция, процентите описват разликите между леченията и в резултат разликите ще се увеличават монотонно с течение на времето. Разликите в скоростите между активни лечения и превозно средство са дадени в таблица 5. Всички активни лечения са имали статистически значително по-ниски нива от превозното средство. Таблица 6 по подобен начин показва разлики в процентите между активните лечения. Честотата е била статистически значително по-малка за всички комбинации от G-Block и Gemcitabine спрямо G-Block 560 mg и Gemcitabine 5 mg, когато се прилага като монотерапия.

ТАБЛИЦА 5
Очаквани разлики спрямо автомобила в темповете на растеж
КонтрастОценете95% C.I.р-стойност
G-Block 560 срещу превозно средство-0,0027(−0,0046-−0,0007)0,007
Гемцитабин 5 срещу превозно средство-0,0042(−0.0062-−0.0022)

ТАБЛИЦА 6
Очаквани разлики между активните лечения в темповете на растеж
КонтрастОценете95% C.I.р-стойност
Гемцитабин 5 срещу G-B 560-0,0015(-0,0037-0,0006)0,166
G-B 5 + Gem. 5 срещу G-B 560-0,0061(−0.0085-−0.0037)

По-нататъшно проучване на ефекта на G-Block сам в модела на ксенографт на тумор на панкреаса на Capan-2 при човека

Целта на този експеримент беше да се изследва реакцията на дозата и да се сравнят различни режими на дозиране. Материалите и методите са описани в Пример 2 само по отношение на G-блоковете. Тествани са два различни режима на дозиране на G-Block. Първият, Q3x4, включваше инжектиране на G-Block на всеки трети ден с общо четири инжекции, т.е. както се извършва в пример 2. Във втория режим, Q3x10, инжекции на G-Block се правят всеки трети ден, с общо десет инжекции. Резултатите са дадени на фиг. 11. Във всеки експеримент 5 групи животни (n = 10) са i.v. инжектира се с носител или G-блок при три концентрации, съответстващи на дози от 0,5 mg/kg телесно тегло, 25 mg/kg телесно тегло или 560 mg/kg телесно тегло.

Ефект на G-блока върху структурата на ECM

Туморите от пример 2 се анализират чрез хистологичен анализ след приключване на изследването. При аутопсия, туморите бяха изрязани от всички животни във всички групи и разделени наполовина, поставени във флакони с формалин (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, NJ), след което фиксирани за около 24 часа, преди да се прехвърлят в етанол. Фиксираните с формалин тъкани бяха вградени в парафин, обработени и оцветени с Н & Е. Резултатите от хистологията на фиг. 12 показват, че животните, лекувани с G-блокове, показват по-малко плътен извънклетъчен матрикс, както се вижда от по-висок процент бели зони в зоните, оцветени с еозин.

Оценка на антитуморната активност на G-блока като единичен агент и в комбинация с Herceptin в модела на ксенографта на човешки тумор на яйчниците SK-OV-3

Целта на това проучване е да се оцени антитуморната активност на G-Block като подобрител в комбинация с Herceptin в модела на ксенотрансплантация на човешки тумор на SK-OV-3.

G-Block (Lot #PolyG 230712- (Dp10, 95% G)) като бял хигроскопичен аморфен прах се доставя от NTNU Technology Transfer AS (Трондхайм, Норвегия) и се съхранява изсушен при стайна температура до употреба. G-блокът на NTNU се разтваря във вода MilliQ до концентрация 70 mg/ml, за да се използва като основен разтвор. Този разтвор се използва за доставяне на доза от приблизително 25 g/kg телесна маса в 60 μl фиксирана доза. Разтворът от 70 mg/ml се разрежда в 0,9% 150 mM NaCl, за да се приготвят други дозиращи разтвори от 25 mg/kg или 0,5 mg/kg в обем от 60 μL фиксирана доза. Всички изчисления за дозиране предполагат 25 g животно. Основният разтвор на NTNU G-Block 70 mg/ml се формулира в началото на изследването и се използва за разреждания преди всяка доза, стерилно се филтрира и съхранява при 4 ° С между дозите. Цялата неизползвана дозираща смес се изхвърля правилно при TD2 след приключване на проучването.

Трастузумаб (Herceptin) се съхранява при стайна температура до употреба. Трастузумаб се прилага в доза от 10 mg/kg в обем от 10 ml/kg.

Контролът на превозното средство се дозира с разтвор от 0,9% 150 mM NaCl при 60 μl фиксиран обем на дозата. Управлението на автомобила се съхранява при стайна температура.

SK-OV-3 ксенографтен клетъчен трансплантат на човешки тумор на яйчниците се получава от ATCC (Manassas, Va.). Културите се поддържат в среда, допълнена с 10% фетален говежди серум и се помещават в 5% CO2 атмосфера. Културите се разширяват в колби за тъканни култури, докато се събират достатъчно количество клетки.

Голи женски мишки Athymic Nude се доставят от Harlan (Germantown, NY). Мишките се приемат на възраст между 5 и 8 седмици. Мишките се поддържат при специфични условия, свободни от патогени. Мишките се хранят с Tekland Global Diet® 2920 × облъчена лабораторна диета за животни (Харлан, Индианаполис, Индиана) и водата в автоклави е свободно достъпна.

SK-OV-3 Модел на ксенотрансплантат на човешки тумор на яйчниците

Женски мишки се инокулират подкожно в десния фланг с 0,1 ml 50% средна/50% Matrigel ™ (BD Biosciences, Bedford, Масачузетс) смес, съдържаща суспензия от туморни клетки SK-OB-3 (приблизително 5,0 × 106 клетки)/мишка).

Лечението започва на 1 ден, съгласно таблица 7 по-долу. Обемът на тумора и телесното тегло се измерват два пъти седмично. Дозирането се извършва, както е описано по-долу в Таблица 7 по-долу.

Мишките се умъртвяват преди края на изследването, ако обемът на тумора надвишава 3000 mm 3. При аутопсия, туморите се изрязват от всички животни във всички групи и се разделят на две, поставят се във флакони с формалин (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, NJ) и се фиксират за около 24 часа, преди да се прехвърлят в етанол. Фиксираните с формалин тъкани се влагат в парафин, обработват се и се оцветяват H & E.

Извършват се t-тест на студент и% T/C изчисления. Изготвят се криви на растежа и графики за промяна на теглото на мишката, за да се оцени толерантността на дозата на терапиите.

Инфилтрация на лимфоцити в туморната тъкан

Пробите от туморната тъкан, получени в Пример 2, бяха отстранени от мишки след смъртта, вграден парафин и подготвен за светлинна микроскопия с H&E оцветяване.

Наблюдават се разлики в наблюдението на лимфоцитите в тъканните участъци от мишките в контролните и третирани с G-блок групи (вж. ФИГ. 13А и В). Имаше по-голяма степен на лимфоцитна инфилтрация в туморната тъкан от мишките, които са получили лечение с G-блок, в сравнение с туморната тъкан от мишки в контролните групи, които не са получили лечение с G-block. Показване на клъстери от инфилтриращи лимфоцити (червени стрелки). Мишките са атимни голи мишки, на които липсват Т лимфоцити (убийствени Т-клетки), но притежават естествени клетки убийци (NK клетки).

Извънклетъчните матрични гелове се приготвят студени от размразени Matrigel (BD Biosciences) при 75% от получената концентрация, съдържащи 2 μg/ml ALEXA488IgG (козе анти човешко, Life technology) и или 5 ml/ml G-блок (DPn 12, 93% G) или контрол на физиологичен разтвор, съответстващ на йонна сила). 200 μl проби се пипетират в камери с покривно стъкло, запечатват се и се загряват при 37 ° С в продължение на 30 минути, за да се предизвика желиране. Използвана е лазерна светлина с висока интензивност (488 линия на аргоновия лазер) за избелване на флуорофор, белязан IgG в интересуващ регион и възстановяване на флуоресценцията в този регион (в резултат на неизбелен белязан IgG, дифундиращ в интересуващата област извън белина регион) се наблюдава.