Принос от Джон Дж. Мекаланос, 12 юни 2011 г. (изпратен за преглед на 4 април 2011 г.)

cholerae

Резюме

ChIP, съчетан със секвениране от следващо поколение (ChIP-seq), революционизира картографирането на целия геном на ДНК-свързващи протеинови места. Въпреки че ChIP-seq бързо получава подкрепа в еукариотни системи, той остава недостатъчно използван при картографирането на местата за свързване на бактериални транскрипционни регулатори. Използвайки необходимия за вирулентност желязо-реагиращ регулатор на поглъщане на железа (Fur), ние докладваме прост, широко приложим ChIP-seq метод в патогена Vibrio cholerae. Комбинирайки нашите ChIP-seq резултати с наличните данни от микрочипове, ние изясняваме директната и индиректната регулация на козината на известните гени, отговарящи на желязото. Ние потвърждаваме подмножество места за свързване с кожа in vivo и показваме общ мотив, присъстващ във всички пикове на Fur ChIP-seq, който има подобрен афинитет на свързване за пречистена кожа от V. cholerae. Допълнителен анализ показва, че козината на V. cholerae директно регулира няколко допълнителни гена, свързани с места за свързване с Fur, разширявайки ролята на този транскрипционен фактор в регулирането на образуването на рибозома, допълнителните транспортни функции и уникалните sRNAs.

Транскрипционните регулатори играят критична роля в клетъчните отговори, като променят моделите на генна експресия, които в крайна сметка водят до протеомни и фенотипни промени. Експресионните профили на бактериите, на които липсват транскрипционни регулатори, се използват успешно за широко определяне на гени, засегнати от изтрития регулатор (1–4). Въпреки че предоставя информативни данни, транскрипционният анализ сам по себе си не може да направи разлика между преки и непреки регулаторни ефекти или да идентифицира регулирани гени, които могат да бъдат безшумни при транскрипция при условията на теста. Най-директното средство за локализиране на гени, контролирани от транскрипционен регулатор, е чрез ChIP, последвано от идентифициране на последователността на ДНК фрагментите, свързани с утаения регулатор (прегледано в справка 5). Свързването на ChIP с технологията на микрочипове (ChIP-ChIP) предостави някои от първите данни за местата на свързване на транскрипционен фактор в целия геном както в прокариотни, така и в еукариотни системи (прегледани в справки 6 и 7). Неотдавнашният технологичен напредък позволи на ChIP да се комбинира с последователност от следващо поколение (ChIP-seq), която предлага по-голямо покритие, по-висока разделителна способност и по-малко шум и изисква по-малко проба от ChIP-ChIP.

След въвеждането му през 2007 г., ChIP-seq беше приет бързо за анализ на еукариотните транскрипционни фактори (прегледан в реф. 8), но все още не е използван значително за изследване на бактериалните транскрипционни регулатори. Доколкото ни е известно, са публикувани само две изследвания с използване на ChIP-seq при бактерии, отчитащи картографирането на ремоделиращите хроматин протеини HN-S и Fis в Escherichia coli (9) и DosR транскрипционния регулатор при Mycobacterium tuberculosis (10). Тази оскъдност на проучванията може да отразява липсата на ChIP-качествени антитела за бактериални протеини (11) или неоптимална експресия на регулатора от интерес при лабораторни условия.

Бактериалният регулатор на поглъщането на железен желез (Fur) регулира транспорта на желязо и хомеостазата при много бактерии (прегледани в референции 12-14). Желязото е необходимо за ензимните функции; излишъкът от свободно желязо обаче може да бъде вредно, като увеличи окислителните щети (15). Когато се свързва с Fe 2+, Fur се свързва със специфични ДНК сайтове, наречени „Fur кутии“, разположени близо до или в промоторния регион на целевите гени, блокирайки достъпа до РНК полимераза и потискайки генната експресия.

Описанието на кутията Fur и нейната връзка с Fur е сложно (справки 16 и 17 и прегледани в справки 13 и 18). Кутия Fur е описана първо в E. coli като 19-bp палиндромна последователност, помещаваща Fur димер (19); Въпреки това, някои места за свързване с козина в Е. coli съвпадат само с 11 от 19 прогнозирани консенсусни бази. Кутиите с козина са предсказвани и при други бактерии, включително Vibrio cholerae, въз основа на подреждане на мотиви на 5 ′ UTR на гени, регулирани с Fur (20). Няколко ДНК-свързващи характеристики на Fur не могат да бъдат обяснени с проста палиндромна последователност. Експериментите с отпечатване на крака показват, че Fur защитава регион, значително по-голям от Fur Box, което предполага, че той взаимодейства с ДНК извън предсказания регион. Освен това, множество димери на Fur могат да се полимеризират, обвивайки ДНК в региони, които нямат съответстващи консенсусни последователности на Fur Fur (21, 22). За да се обяснят тези и други явления, са предложени алтернативни кутии за кожа, включително последователност, включваща три 6-bp повторения (23) и припокриващи се 13-bp 7-1-7 мотиви (24).

За да дефинираме регулацията на vcFur по-пълно, ние демонстрираме проста, широко приложима платформа за картографиране на сайтове, свързващи транскрипционен фактор в V. cholerae, използвайки ChIP-seq. Сравнихме наличните транскрипционни отговори на кожени мутанти с нашите геномни данни за местоположението на свързване, за да идентифицираме преки и непреки регулаторни цели на vcFur, както и допълнителни места за свързване. Нашите резултати осигуряват биохимично валидиране на предходни директни vcFur регулаторни прогнози, дефинират vcFur кутия с подобрено свързване с vcFur и последици за vcFur-ДНК свързване и идентифицират допълнителни роли на vcFur в регулирането на образуването на рибозоми, транспортните функции и sRNAs. Нашите резултати потвърждават използването на този метод ChIP-seq за бактериални регулатори на транскрипцията, осигуряват подкрепа за комбиниране на информация за транскрипционно регулаторно място на свързване с наличен експресионен анализ и значително разширяват мрежата от влияния на този почти повсеместен бактериален транскрипционен регулатор.

Резултати

ChIP-Seq идентифицира преки и косвени цели сред регулираните от vcFur гени.

Доказано е, че зависимото от козината регулиране на различни гени варира в зависимост от фазата на растеж и състоянието (26-28). Нивата на vcFur протеин се утрояват при влизане в стационарна фаза (25), потенциално променяйки спектъра на неговите ДНК-свързващи цели. Ние предположихме, че по-високите нива на vcFur биха разкрили по-добре пълния спектър на неговите геномни места на свързване.

Известни vcFur-регулирани гени, свързани с vcFur ChIP-пикове

Анализът на ChIP-Seq разширява броя на сайтовете, свързващи vcFur.

Идентифицирахме допълнителни 34 vcFur ChIP пика, свързани с гени/sRNAs (Таблица 2). Ние широко категоризираме тези гени в транспорт, транскрипция и транслационна регулация, подвижност, посреднически метаболизъм и хипотетични ORF. Четири пика на vcFur ChIP припокриват началните кодони на множество близко съседни гени. Липсата на данни за израз, показващи контрола vcFur, изключва незабавното свързване на пиковете само с един ORF.

Нови vcFur ChIP, свързани с пикови ORF и sRNAs

За да потвърдим свързването на vcFur с тези локуси, ние избрахме подмножество от нови пикови местоположения и използвахме количествена PCR (qPCR), за да определим кратното обогатяване на тези геномни локуси в нашите vcFur ChIP проби в сравнение с контролната ДНК преди ChIP (Таблица 3). За справка определихме обогатяването на свързването на vcFur нагоре по веригата с известния регулатор, насочен към ентеробактинов рецептор ген A (irgA) и tonB1, както и два нецелеви геномни локуса [ендонуклеаза IV (nfo) и изоцитрат дехидрогеназа (icd)] като отрицателни контроли. Количественото обогатяване на гънките на седем нови пика на vcFur, идентифицирани чрез ChIP-seq, показва еквивалентно или по-голямо обогатяване от свързването към промоторните региони на irgA и tonB1. Тези резултати поддържат нашите ChIP пикове като съдържащи автентични сайтове, свързващи vcFur. Поразително е, че шест от тези седем свързващи vcFur места показват по-голямо обогатяване от ChIP, отколкото известния vcFur-регулиран тонВ1 ген промотор. Освен това, две от тези vcFur-свързващи места показват по-голямо обогатяване с ChIP, отколкото промоторната област на irgA. Особено важно е място за свързване на vcFur нагоре по течението на алтернативен рибозомен протеин, VC0878, което показва ∼300-кратно обогатяване.

Валидиране на свързването на vcFur с нови геномни локуси

Анализът ChIP-Seq дефинира подобрена кутия за кожи на V. cholerae.

Кутията за vcFur ChIP Fur имаше по-строго изискване за положение на остатъци, отколкото кутията vcFur, предвидена от проучвания с микрочипове. Сравнихме свързването на пречистен vcFur с дефинирани от микрочипове и ChIP-seq кутии vcFur и контролен полиА/Т ДНК дуплекс. Използвахме vcFur, възстановен със Zn 2+, тъй като този йон е необходим за структурата на vcFur, не се окислява бързо и позволява vcFur да свързва известни промотори толкова ефективно, колкото vcFur, съдържащ Fe 2+ (38). Пречистеният vcFur обвързва както vcFur кутиите, дефинирани от microarray, така и ChIP-seq, но не свързва контролния дуплекс (Фиг. 1C). Интересното е, че vcFur е обвързал дефинираната от ChIP кутия vcFur 3.1 ± 1.1 пъти по-силно от предвидената по-рано vcFur кутия (фиг. 1С). Идентифицирането на тази консенсусна Fur кутия във всички ChIP пикове допълнително подкрепя валидността на тези геномни региони като истински сайтове за свързване на vcFur.

ChIP-Seq - Идентифицираните свързващи сайтове разширяват набора от vcFur-регулирани гени и sRNAs.

vcFur-зависима регулация на гени, свързани с нови vcFur ChIP пикове

Дискусия

Изчислителните методи успешно прогнозират места за свързване на vcFur в генома на V. cholerae (42, 43). Нито едно изчислително проучване обаче не успя да предвиди спектъра на местата за свързване на vcFur, идентифицирани в нашия анализ на ChIP-seq. Честно казано, биоинформативните алгоритми трябва да разчитат на наличните в момента експериментални данни, които може да са непълни, за да извлекат мотиви за търсене. Ще бъде интересно да се определи как разширеният набор от места за свързване на vcFur ще повлияе на изчислителните прогнози на местата за свързване с кожа.

Комбинирайки ChIP-seq анализ с наличните данни за изразяване, можем да разграничим ясно между пряко и непряко регулиране на vcFur и сега предлагаме много по-широка роля на vcFur в директното регулиране. Нашият анализ значително разширява броя на експериментално потвърдените vcFur-свързващи сайтове и включва още няколко гена, които са под пряка регулация на vcFur. Има няколко възможни причини, поради които гените, свързани с нашите vcFur-свързващи сайтове, не са били идентифицирани в проучвания с микрочипове. Цели като sRNAs и малки ORFs като VC0878 не бяха включени в микрочипа и следователно нямаше да бъдат тествани. В козина: Tn мутант, нашите резултати от qPCR показват повишаване на регулирането на irgA с повече от 200 пъти (Таблица 4). Използвайки qPCR, ние показахме, че три гена, свързани с новите vcFur-свързващи места, също са регулирани нагоре в fur: Tn мутант, но в много по-малка степен от irgA (Таблица 4). Чувствителността на анализа на микрочиповете може да не е била достатъчно висока, за да се открият тези относително малки промени в генната експресия, или тези относително малки промени може да не са били възпроизводими сред експериментите.

Нашите резултати показват, че високата степен на свързване на vcFur в промоторен регион не корелира пряко с високо ниво на регулация на асоциирания ген (Таблици 2 и 3). Контекстът на сайта, свързващ vcFur, може да бъде толкова важен, колкото и по-важен от афинитета на vcFur към сайта. Други транскрипционни фактори, като аеробния респираторен контролен протеин (ArcA), регулаторният протеин за редукция на фумарат и нитрати (Fnr) и цикличен AMP рецепторен протеин (CRP), могат да се свързват на места в близост до или припокриващи се места на vcFur. В зависимост от условията на растеж, тези фактори могат да увеличат или намалят свързването на vcFur значително на определено място.

Показахме директна регулация на три от гените, свързани с нови върхове vcFur, използвайки мутант fur: Tn (Таблици 2 и 4). VCA1098 споделя силна хомология с ABC никел транспортната единица NikA (40) и нашите експерименти показват, че нарушаването на VCA1098 намалява чувствителността на V. cholerae към извънклетъчния никел (фиг. 1D). Тези резултати предполагат, че VCA1098 може да играе роля в транспорта на никел. Интересното в Helicobacter mustelae е, че наскоро е показано, че няколко гена, анотирани за придобиване на желязо, се използват за усвояване на никел (44). Освен това е показано, че NikA свързва хема, което предполага многофункционално използване на VCA1098 (45). Нашите резултати също показват значително ChIP обогатяване на свързването на vcFur с промоторния регион на VC0878, алтернативния L31 рибозомен протеин. Хомологът VC0878 Bacillus subtilis се регулира от регулатора на поемане на цинк Zur и помага за буфериране на бактерията срещу цинковото гладуване (46). Освен това е доказано, че транспортирането на цинк се контролира от Fur in Pasteurella multocida (47). Пряката асоциация на гени, потенциално участващи в регулирането на Ni 2+ и Zn 2+, предполага, че vcFur може да има допълнителни роли извън регулацията на желязото.

Идентифицирахме силни пикове на vcFur ChIP в междугенните региони между VC0142/VC0143 и VCA0452/VCA0453. Тези пикове не се намират в близост до началното място на който и да е ген. Livny et al. (41) идентифицира сРНК в междугенния регион между VC0142/VC0143 по време на изчислителен скрининг за сРНК на V. cholerae. Нашите Northern blots показаха повишена експресия на тази sRNA в козината: Tn мутант (Фиг. 1Е). В комбинация с локализацията на vcFur ChIP, ние показахме, че vcFur директно регулира тази непроучена sRNA. Също така идентифицирахме sRNA в междугенния регион между VCA0452/VCA0453, който не показва vcFur-зависима регулация; обаче, vcFur-зависима регулация може да се появи при различни условия на растеж.

Наблюдавано е кръстосано регулиране на козината/RpoS при Vibrio vulnificus и Е. coli (48, 49), но не наблюдаваме повишаване на регулацията на rpoS при мутант на кожа: Tn (Таблица 4). Както при всички други гени, свързани с vcFur-свързващи места, силната vcFur-зависима регулация може да изисква алтернативни условия на растеж.

Идентифицирането на няколко допълнителни места за свързване на vcFur ни позволи да предскажем подобрена консенсусна последователност на кутията на V. cholerae Fur. Този мотив е намерен в пиковете на vcFur ChIP близо до транслационното начално място на всеки асоцииран ORF. Анализите in vitro показаха, че този мотив свързва vcFur малко по-добре от предвидената по-рано vcFur кутия, която използва само подмножество от нашия свързващ регион. Интересното е, че и двете кутии споделят еднакъв обхват от бази. Нашата прогноза има по-строго изискване за 3 ′ края, което предполага, че този регион може да осигури повишено свързване с vcFur. Способността на нашия прогнозиран мотив да свързва ефективно vcFur и присъствието му във всички идентифицирани ChIP пикове (сайтове, свързани с vcFur) помагат да се подкрепи валидността на новите сайтове за свързване на vcFur, докладвани тук.

Материали и методи

Щамовете и плазмидите са изброени в таблица S3. Секвенирането беше извършено с помощта на HeliScope Single Molecule Sequencer. Анализът на данните за секвениране беше извършен с помощта на софтуер за геномна работна маса CLC. 6ХНеговият С-терминален маркиран vcFur се пречиства чрез афинитетна хроматография. За подробна информация вижте SI материали и методи.

Благодарности

Благодарим на д-р Д. Ивен Камерън за подкрепата при използването на библиотеката за транспозон на V. cholerae. B.W.D. беше подкрепена от Мемориалния фонд за медицински изследвания на Джейн Кофин Чайлдс и от Националния изследователски съвет на Канада H. L. Holmes Award. Тази работа беше подкрепена от Национален здравен институт Grant AI-018045 (на J.J.M.).

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: john_mekalanoshms.harvard.edu .