Концептуализация на роли, Куриране на данни, Официален анализ, Придобиване на финансиране, Методология, Администриране на проекти, Ресурси, Надзор, Проверка, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

кръстосаната

Отдел по инфекциозни болести, Катедра по медицина, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати, Център за стомашно-чревна биология и болести, Медицински департамент, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, методология, администриране на проекти, ресурси, валидиране, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отдел за инфекциозни болести и международно здравеопазване, Катедра по медицина, Университет на Вирджиния, Шарлотсвил, Вирджиния, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение за компютърна и системна медицина, Катедра по хирургия и рак, Империал Колидж Лондон, Великобритания

Концептуализация на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отдел за инфекциозни болести и международно здравеопазване, Катедра по медицина, Университет на Вирджиния, Шарлотсвил, Вирджиния, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, ресурси, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение по биомедицинско инженерство, Университет на Вирджиния, Шарлотсвил, Вирджиния, Съединени американски щати

Отдел за инфекциозни болести и международно здравеопазване, Катедра по медицина, Университет на Вирджиния, Шарлотсвил, Вирджиния, Съединени американски щати

Писане на роли - преглед и редактиране

Отделение за детски инфекциозни болести, Детска болница в Ричмънд към Университета на Вирджиния в Британската общност, Ричмънд, Вирджиния, Съединени американски щати

Роли Куриране на данни, визуализация

Отдел по инфекциозни болести, Медицински отдел, Университет на Северна Каролина в Чапъл Хил, Чапъл Хил, Северна Каролина, Съединени американски щати

Проверка на ролите, визуализация

Партньорски център за стомашно-чревна биология и болести, Катедра по медицина, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, писане - преглед и редактиране

Партньорски център за стомашно-чревна биология и болести, Катедра по медицина, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill, Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, писане - преглед и редактиране

Отделение по биология, Университет Джорджтаун, Вашингтон, окръг Колумбия, Съединени американски щати

Ресурси за роли, писане - преглед и редактиране

Отделение по биомедицинско инженерство, Университет на Вирджиния, Шарлотсвил, Вирджиния, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отделение за компютърна и системна медицина, Катедра по хирургия и рак, Империал Колидж Лондон, Великобритания

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, методология, администриране на проекти, ресурси, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отдел за инфекциозни болести и международно здравеопазване, Катедра по медицина, Университет на Вирджиния, Шарлотсвил, Вирджиния, Съединени американски щати

  • Лутер А. Бартелт,
  • Дейвид Т. Болик,
  • Jordi Mayneris-Perxachs,
  • Глинис Л. Колинг,
  • Грегъри Л. Медлок,
  • Edna I. Zaenker,
  • Джефри Доновиц,
  • Роза Вигуна Томас-Бекет,
  • Алисън Рогала,
  • Иън М. Карол

Фигури

Резюме

Резюме на автора

Недохранените деца са изложени на множество последователни и често пъти постоянни ентеропатогени. Известно е, че чревните микробни нарушения и възпаление допринасят за патогенезата на недохранването, но как ко-патогените взаимодействат помежду си, с резидентната микробиота или с гостоприемника, за да променят тези пътища, е неизвестно. Използвайки нов модел на ентерална коинфекция с Giardia lamblia и ентероагрегативна Escherichia coli при мишки, хранени с диета с дефицит на протеини, ние идентифицираме растежа на гостоприемника и чревните имунни реакции, които са диференцирано медиирани от взаимодействия патоген-микроб, включително паразитно-медиирани промени в чревните микробни ко-метаболизъм на гостоприемника и променени имунни отговори по време на коинфекция. Нашите данни моделират как кумулативните експозиции на ентеропатоген в ранния живот постепенно нарушават чревния имунитет и метаболизма на гостоприемника по време на решаващи периоди на развитие. Освен това, проучвания в този модел на коинфекция разкриват нови прозрения в екологичните и микробните детерминанти на патогенността за често срещани, но слабо разбрани ентеропатогени като Giardia lamblia, които може да не отговарят на съществуващите парадигми на микробната патогенеза, базирани на модели, проектирани от един патоген.

Цитат: Bartelt LA, Bolick DT, Mayneris-Perxachs J, Kolling GL, Medlock GL, Zaenker EI, et al. (2017) Кръстосаната модулация на патоген-специфичните пътища засилва недохранването по време на ентерална коинфекция с Giardia lamblia и ентероагрегативна Escherichia coli. PLoS Pathog 13 (7): e1006471. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006471

Редактор: P'ng Loke, Нюйоркски университет, САЩ

Получено: 13 януари 2017 г .; Прието: 14 юни 2017 г .; Публикувано: 27 юли 2017 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено отчасти от Националния институт по здравеопазване Национален институт по алергия и инфекциозни болести Grant K08-AI108730 (LAB), U19-AI109776 (RLG) и AI-109591 (SMS) [https: //www.niaid.nih .gov], Национален институт по диабет, храносмилателни и бъбречни болести Grant P30-DK034987 (Центърът за стомашно-чревна биология и болести в Университета на Северна Каролина в Chapel Hill (Microbiome Core и Histology Core)), [https: // www .niddk.nih.gov] и Национален институт по общи медицински науки # 108501 (GLK, GLM и JP) [https://www.nigms.nih.gov/Pages/default.aspx]. Това проучване беше подкрепено отчасти и от безвъзмездните средства на Фондация Бил и Мелинда Гейтс OPP-1066140 и OPP 1137923 (RLG) [http://www.gatesfoundation.org]. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Прочетох политиката на списанието и авторите на този ръкопис имат следните конкуриращи се интереси: LAB беше временен консултант на Lupine Pharmaceuticals, юни - декември 2015 г.

Въведение

За да се справим с това как микробните адаптации на червата към недохранване се комбинират с кумулативно натоварване на ентеропатогена, за да повлияят на растежа на гостоприемника, имунните отговори на лигавиците и метаболизма, разработихме нов интегриран модел на микробни нарушения, предизвикани от недохранване и мултипатогенна ентеропатия. G. lamblia и EAEC, патогени, често откривани при недохранени деца, са избрани като патогени от интерес. В допълнение към идентифицирането на нови специфични за патогена пътища, които допринасят за недохранването, ние демонстрираме комодулация на имунните и метаболитните реакции на лигавицата, които се сближават, за да влошат растежа на гостоприемника. Освен това, чревната микробно-медиирана протеолиза се усилва във все по-губещия гостоприемник, заедно с изчерпване на съвместните метаболитни адаптации в енергийните регулаторни и компенсаторни метаболитни пътища.

Резултати

Giardia преодолява микробиота-медиирания патогенен клирънс по време на недохранване с протеини и се комбинира с недохранване с протеини, за да насърчи увреждане на растежа, изобилие от 16S в тънките черва и променен имунитет на лигавицата

Миши чревна микробиота може диференцирано да предотврати продължителна колонизация на Giardia lamblia, дори при гостоприемници с дефицит на Т и В-клетки. По този начин ние и други изследователи използвахме непрекъснати антибиотици (ампицилин, ванкомицин, неомицин) (Abx) в питейната вода за засилване на инфекцията с G. lamblia [18–21]. Използвайки този коктейл Abx, по-рано публикувахме, че предизвиканието на G. lamblia (Асамблея B, щам H3 кисти) води до откриваемо отделяне при 10 4 −10 5/грам изпражнения чрез qPCR на 18S малката рибозомна субединица през първите 5–7 дни след предизвикателство (ранна инфекция). Но за разлика от клирънса след предизвикване на G. lamblia (Асамблея A, щам WB трофозоити), отделянето на G. lamblia H3 се увеличава с

30 пъти) и силно увеличен при коинфекция (

80 пъти). IL-9 беше значително повишен при моноинфектирана с Giardia и от

20-кратно при коинфектирани мишки, заедно с тенденция към по-големи IL-4 и IL-13. Всяка група демонстрира намаляване на IFNy, което е значително при моноинфектирани мишки от EAEC. CCL5 беше повишен (

2 пъти) при мишки, заразени с EAEC и коинфекции. В съответствие с ранното разширяване на миелоидните клетки при мишки, заразени с EAEC, CXCL8 (IL-8/KC) също е повишен при мишки с EAEC и коинфекция (

1,6 пъти). CCL11 (еотаксин) е уникално повишен (

Индуцираните от Giardia промени в чревните микробни ко-метаболити на протеолиза продължават (4-HPA сулфат, IAG) или се припокриват (PAG, 4-CG, 4-CS) с тези, наблюдавани само по време на инфекция с EAEC и тези метаболити дори допълнително увеличено при коинфектирани мишки (фиг. 4Е). Въпреки това, EAEC-медиираните увеличения на TMA и TMAO (фиг. 4Е), показателни за микробно-зависим разпад на холин, са били обърнати при мишки, инфектирани с Giardia (фиг. 4Е), и приличат на метаболитни смущения в холиновия метаболизъм само на инфекцията на Giardia (фиг. 4E) 4Е). По подобен начин повишената екскреция на таурин при мишки, заразени с Giardia, продължава чрез коинфекция (Фигура 4Е). Докато и двете инфекции повишават липидното окисление, очевидно в повишените продукти на разграждане на β-окислението (хексаноилглицин, бутирилглицин и изоваларилглицин), заедно с предшественика на β-окислителния ацетил-карнитин, метаболизмът по време на коинфекцията се измества от β-окислението, както е показано чрез намаляване в ацетил-карнитин и β-окислителни метаболити надолу по веригата. Едновременно с това, коинфекцията доведе до инверсия на съотношението креатин: креатинин, което предполага променен мускулен метаболизъм в сравнение с двете инфекции самостоятелно (Фигура 4Е). И накрая, адаптациите на енергийните разходи на приемащата страна по пътя на никотинамид (NMND и NAO) само по време на инфекция с Giardia (фиг. 4Е) бяха угасени след коинфекция с EAEC (фиг. 4Е).

Дискусия

Методи

Декларация за етика

Това проучване включва използването на мишки. Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни от Националния здравен институт. Протоколът е одобрен от Международния комитет по грижа и употреба на животните към Университета на Вирджиния (номер на протокола на Комитета за грижи и употреба на животните: 3315). Набавянето на тъкани беше извършено след анестезия (кетамин хидрохлорид и ксилазин) и цервикална дислокация и бяха положени всички усилия за минимизиране на страданието.

Животни и недохранване

Всички експерименти са проведени с помощта на отбити мъжки мишки C57Bl/6, получени от Jackson Laboratories на 3-седмична възраст. Мишките са били инициирани или с диета с дефицит на протеини (PD; 2% протеин, лаборатории Harlan или изследователски диети) или изокалорична контролна диета (CD; 20% протеин, Harlan Laboratories или Research Diets) в рамките на три дни след пристигането (24 дни от живота) ). За всички експерименти мишките бяха рандомизирани в групи, съответстващи на теглото и продължиха с експериментални диети през цялото време на експеримента. Мишките, получаващи непрекъснати антимикробни средства, получавали ампицилин (1 mg/ml, Fischer), ванкомицин (1 mg/ml, Novaplus) и неомицин (1,4 mg/ml, Durvet) в питейна вода, променяли се ad libitum или на всеки пет дни. Серийните тегла се получават на всеки 1–7 дни от пристигането до края на експеримента. Изпражненията се събират през ден след инфекция [18].

Giardia lamblia и ентероагрегативни препарати от Escherichia coli

Пречистените пречистени кисти на G. lamblia H3 (Асамблея В) са закупени от Waterborne, Inc. (Ню Орлиънс, Луизиана). Кистите се измиват и разреждат в PBS и се използват в рамките на 48 часа след пристигането. Всяка заразена мишка получи инокулум от 10 4 −10 6 кисти. Трофозоитите на G. lamblia H3 също са получени от Waterborne, Inc и се поддържат в модифицирана среда TYI-S-33 преди приготвянето на инокула (10 7/мишка), както е описано по-горе [18]. Щамът EAEC 042 първоначално е получен от Джеймс Натаро от Университета на Вирджиния. За всеки експеримент се отглежда отделен инокулум от 10 9/мишка от запасен глицерол, поддържан при -80 ° С, и се приготвя в DMEM среда с висока глюкоза, както е описано по-горе [17]. Всички препарати за патогени се поддържат на лед, докато се прилагат през орален сондаж, като се използват 22 игли за хранене в 100 обема обеми. Неинфектираните контроли се анализират по подобен начин с 100 μL PBS (за Giardia) или DMEM с висока глюкоза (за EAEC).

Ex vivo изброяване на Giardia trophozoites

По време на евтаназията, 4-сантиметровите сегменти на тънките черва бяха отстранени, започвайки на 0,5 см от пилорния сфинктер, и поставени в 4-милилитров охладен PBS върху лед за 30 минути. Трофозоитите бяха идентифицирани с помощта на обърнат микроскоп и преброени на хемацитомер с граница на откриване от 10 4 трофозоита/ml.

ДНК екстракция за откриване на патогени и микробиоти

ДНК от изпражнения и/или чревна тъкан се извлича от размразени проби, като се използва QIAmp комплект за изпражнения на ДНК (Qiagen), както е описано по-рано [18]. За откриване на 16S рРНК гени, модификации за обогатяване на откриването, включително допълнителни стъпки на хомогенизиране в епруветки с топчета (UltraClean фекални ДНК топчета, Mo Bio Laboratories) в 400/360μL ASL/ATL буфер с помощта на Mini-Beadbeater за 1 минута, 30/40 μL протеиназа К за хомогенати изпражнения/тъкани и инкубация на тъкани при 56 ° C в продължение на два часа [70].

Полимеразна верижна реакция в реално време за Giardia lamblia и количествено определяне на EAEC и бактериални групи

Вижте таблица S1 за списък на генни цели, използвани в това проучване. За всички проучвания на qPCR се провежда серийно разреждане със стандартна крива за съответната цел в реплики на всички плаки за валидиране. Проучването се счита за валидно само ако системата за откриване на BioRad CFX открие ефективност от 90–110% и корелация r 2> 0,98. Както експериментални (т.е. заразени фекални ДНК на животни), така и контроли (т.е. неинфектирани фекални ДНК на животни) се провеждат върху плочата. Контрол без шаблон беше универсално включен на всяка плоча за контрол на неспецифични усилвания.

Giardia lamblia и EAEC

16S количествено определяне на общите бактерии, фирмикути, бактероидети и ентеробактерии

Общо 16S V3-V4 библиотечно количествено определяне, последователност на Illumina и анализ на данни

20 000) с еднаква ширина (0,00055 ppm). Областите между δ 4.50–5.00 бяха премахнати, за да се сведе до минимум ефектът от базовите ефекти, причинени от несъвършеното потискане на водата. След това всеки спектър се нормализира на единица площ. Многовариантното моделиране беше извършено в Matlab, използвайки вътрешни скриптове. Това включва анализ на основните компоненти (PCA), използващ мащабиране по парето и ортогонална проекция към скрити структури-дискриминантни анализи (OPLS-DA), конструирани с помощта на единично дисперсионно мащабиране. Моделите OPLS-DA са конструирани, за да подпомогнат интерпретацията на модела. Тук 1 H NMR спектроскопски профили бяха използвани като матрица на дескриптора и членството в класа (например Giardia, EAEC, неинфектирано) беше използвано като променлива на отговора. Предсказуемото представяне (Q 2 Y) на модела беше изчислено с помощта на 7-кратен подход за кръстосано валидиране и валидността на модела беше установена чрез тестване на пермутации (1000 пермутации) [16]. Метаболитите, свързани с поредица от двойни OPLS-DA модели, бяха идентифицирани чрез коефициента на корелация (R) с членството в класа и обобщени в топлинна карта.

Поточна цитометрия за клетки lamina propria и luminex за профили на цитокини и хемокини

За отговорите на лигавичните цитокини и хемокини 0,5–1,0 cm илеум незабавно се поставят в течен азот по време на евтаназия и се съхраняват при -80 ° C до употреба. Протеинът се събира от илеумни лизати, които са направени с помощта на лизисен буфер, съдържащ 50 mM HEPES, 1% Triton X-100 и инхибитор на Halt протеаза върху лед и хомогенизиран в циркониеви зърна (Biospec) с помощта на Mini-Beadbeater (Biospec) за 60 секунди. Изяснените супернатанти се съхраняват при -80 ° С. Мултиплексното количествено определяне на белтъка беше извършено с помощта на Luminex 100 IS System в Университета на Вирджиния Biomolecular Core.

Измерване на възпалителен маркер на цекални/фекални

Статистически анализ