L.J. Дейвисън

1 Катедра по ветеринарна медицина, болница на Queen's Veterinary School, Университет в Кеймбридж, Кеймбридж, Великобритания

2 Медицинска катедра Nuffield, Център за доверие на Welcome за човешка генетика, Университет в Оксфорд, Оксфорд, Великобритания

А. Притежател

3 Катедра по патология и патогенна биология, Royal Veterinary College, Hatfield, Великобритания

Б. Капак

3 Катедра по патология и патогенна биология, Royal Veterinary College, Hatfield, Великобритания

C.A. О'Калаган

2 Медицинска катедра Nuffield, Център за доверие на Welcome за човешка генетика, Университет в Оксфорд, Оксфорд, Великобритания

Резюме

Заден план

Захарният диабет (DM) при кучета е често срещана ендокринопатия със сложна генетична архитектура. Податливостта към болести при няколко породи е свързана с полиморфизми в гените на имунния отговор, но при породата лабрадор ретривър не са установени генетични асоциации с DM. Делецията в гена на про-опиомеланокортин (POMC) при ретривърите на лабрадор е свързана с повишен апетит и риск от затлъстяване.

Хипотеза/цели

За да се характеризира POMC делецията при лабрадорските ретривъри, да се разработи прост генетичен тест за тази мутация и да се тества хипотезата, че делецията на POMC гена е свързана с повишен риск от DM при тази порода.

Животни

Шестдесет и един недиабетни лабрадор ретривъри на възраст> 6 години и 57 лабрадор ретривъри с DM .

Методи

Проучване за генотипизиране на случай-контрол за сравняване на честотата на делеция на POMC при кучета със и без DM. След полимеразна верижна реакция (PCR) и секвениране, за да се характеризира мутацията, беше разработен и валидиран PCR-базиран тест, използващ 2 различни анализа на полиморфизма с дължина на рестрикционни фрагменти.

Резултати

Делецията от 14 двойки бази беше потвърдена и локализирана в екзон 3 на кучешкия POMC ген. Успешно е разработен PCR-базиран тест за изтриване. Няма връзка между наличието на мутация на делеция на POMC и DM при тази популация кучета лабрадор ретривър (P = .31).

Заключения и клинично значение

Това проучване добавя към съществуващата научна литература, показваща, че има малко доказателства за пряка връзка между затлъстяването и СД при кучета.

Съкращения

Захарният диабет (DM) при кучета е многофакторно заболяване, като се смята, че генетичните и екологичните компоненти допринасят за развитието на състоянието. 1, 2, 3 Очакваното разпространение на DM при кучета е 1 на 3004, 5 и тъй като повечето кучета с диабет са с дефицит на инсулин, заболяването е сравнено с диабет при човек тип 1 и латентен автоимунен диабет на възрастен.3 Това сравнение се подкрепя от наличието на антитела към панкреатичните автоантигени в редица случаи6, 7 и липсата на доказателства за пряка връзка между затлъстяването и развитието на диабет при кучета, за разлика от човешкия диабет тип 2

Материали и методи

Проучване на населението

Кучета с диабет

Проби от кръв на EDTA от диабетични лабрадор ретривъри бяха извлечени от Регистъра и архива на кучешкия диабет в Обединеното кралство в Кралския ветеринарен колеж, Лондонски университет. Диагнозата е поставена от ветеринарни лекари в първичната помощ въз основа на съвместими клинични признаци на полидипсия, полиурия и загуба на тегло и документирана персистираща хипергликемия (> 162 mg/dL), повишаване на серумната концентрация на фруктозамин или и двете. Повечето кучета получават инсулиново лечение по време на вземането на пробите. Кучета с диабет с ранно начало (т.е. 1 и качеството на пробите се оценяват с анализатор Nanodrop 2 преди полимеразна верижна реакция (PCR). Когато е необходимо, пробите се екстрахират, разреждат или и двете до подходяща работна концентрация (5–20 ng/μL) преди употреба.

Откриване и потвърждаване на POMC мутация

Праймерите са проектирани да усилват фрагмент от 560 базисни двойки (bp), съдържащ кучешки POMC exon 3 (K9POMC ‐ 1 смислен грунд: 5′ ‐ GCGGCCCTAACCCTCTG ‑ 3 ′ и K9POMC ‐ 2 антисенсов грунд: 5′ ‑ GCCACCAGGCCGTACTC ′), с температура на отгряване от 66 ° C, за която е установено, че е оптимална. За проектиране на праймерите е използван софтуер Primer 3, а за тази цел транскриптът на гена на POMC на Canis lupus familiaris (Transcript: POMC-201 ENSCAFT00000006656) е изтеглен от Ensembl на адрес http://www.ensembl.org/Canis_familiaris/Info/Index. Праймерите се доставят от IDT технологии 3 и всички PCR реакции се извършват на MJ PTC-225 термичен циклер 4, използвайки Hi-fidelity Hotstart Q5 ензим 5 .

Ампликоните се визуализират под UV светлина с етидиев бромид, след 5% електрофореза в агарозен гел при 100 V в продължение на 2 часа, за да се позволи оптимална разделителна способност на лентите. Продуктите на полимеразна верижна реакция се пречистват с Qiagen PCR комплект за почистване 1 и се подават за секвенция на Sanger 6 в посока напред и назад, като се използват същите праймери, използвани за PCR. Въз основа на тези резултати е проектиран и тестван допълнителен набор от праймери, като идентифицираната делеция е разположена по-централно в PCR продукта. Тази двойка праймери беше използвана при всички следващи PCR реакции (K9POMC ‐ 3 смислен праймер: 5′ ‐ AAGTACGTCATGGGCCACTT ‐ 3 ′ и K9 POMC ‐ 4 антисмислен грунд: 5′ ‑ TTTTGAACAGCGTCACCAGG ‐ 3 ′) при оптимална температура на отгряване 68 ° C.

Където е посочено, анализ на полиморфизма с дължина на рестрикционен фрагмент (RFLP) е извършен върху PCR продукти в 1 × NEB CutSmart буфер и ApaI ензим 5 или SacII ензим 5 за 1 час при 37 ° С. Онлайн софтуерът NEB Cutter v2.0 на адрес http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ е използван за определяне на подходящи ензими за тази цел. След разграждане ДНК се отделя върху 4% агарозни гелове, съдържащи етидиев бромид за 60 минути при 120 V и се визуализира под UV светлина. Изравняванията на последователностите бяха извършени на http://www.bioinformatics.org/sms2/ и функционална оценка на изтриването на http://www.uniprot.org/uniprot/E2RQ39.

Статистически анализ е извършен с R версия 3.2.3.18. Извършен е анализ на хи-квадрат, за да се сравнят честотите на алелите между диабетните и недиабетните лабрадор ретривъри, като се използва таблица за непредвидени обстоятелства 3 × 2 със значителна стойност P, зададена на .05.

Резултати

В проучването бяха включени общо 118 кучета лабрадор ретривър, от които 57 диабетици и 61 недиабетни. Характеристиките на тези кучета са представени в таблица 1. Мутацията в гена на кучешки POMC е докладвана като делеция на 14-базова двойка в екзон 3,19, но по-точни подробности за делецията не са били публикувани преди предприемането на това проучване. За да се потвърди това откритие, регионът на гена POMC, съдържащ екзон 3, се амплифицира (K9POMC-1 и K9POMC-2 праймери) и се секвенира в подмножество на кучетата (Фигура 1). Прогнозираният размер на ампликон е 520 bp (алел от див тип) и 506 bp (алел за делеция на POMC).

чувствителността

Електрофореза с агарозен гел след усилване на 520-bp регион на геномна ДНК от 6 кучета лабрадор ретривър, като се използват праймери, проектирани да фланкират екзон 3 на POMC в ампликона. Променливостта в размера на ампликоните показва, че някои кучета са били хетерозиготни за делеция от 14 базисни двойки (C3 и C5), а 1 куче е хомозиготно за делецията (C4). Това беше потвърдено чрез секвениране.

маса 1

Описателна статистика на изследваната популация

Средна възраст (години) [Обхват] Кастрирани мъжки (%) Цяло мъжки (%) Кастрирани женски (%) Цялостно женски (%) Неизвестен пол (%) Общ брой кучета
Контролна популация9 [6–13]19 (31)13 (21)25 (41)2 (3)2 (3)61
Диабетно население9 [6–13]18 (32)14 (25)25 (43)0 (0)0 (0)57

Последователността на Sanger беше използвана, за да се потвърди наличието на делеция от 14 базисни двойки в кучешкия POMC ген, както беше съобщено по-рано19 (Фигура 2), тъй като тази работа е предприета преди пълното публикуване на мутационната последователност. анотацията на кучешката геномна последователност, съдържаща това заличаване, сравняване на различни бази данни. Въз основа на публикувания RefSeq кучешки POMC ген (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_844370.4), заличаването се крие в екзон 3. Въпреки това, въз основа на транскрипта на Ensembl (POMC-201 ENSCAFT00000006656) вместо да бъде в екзон 3, както се съобщава в първоначално резюме, 19 това заличаване включва малък 2-базисен чифт "интрон" (между екзони 3 и 4), плюс първите 12 базови двойки на екзон 4 (Фигура 3 А) . Директното секвениране на геномна ДНК от кучетата лабрадор ретривър показва, че „N“ в позиция 547 на кодиращата последователност RefSeq отсъства и че има допълнителна G нуклеотидна база в позиция 562, непосредствено пред AG, анотирана като интрон в Последователност на Ensembl (Фигура 3 А). По-нататък заличаването е посочено като алел делта-екзон 3.

Следи от последователност на Sanger от кучета с хомозиготни, хетерозиготни и диви генотипове за делеция на POMC от 14-базова двойка. Началната точка на изтриването е илюстрирана с червена пунктирана линия, а крайната точка - със синя пунктирана линия.

След като мутацията беше дефинирана в детайли, бяха проектирани 2 нови двойки праймери (K9POMC-3 и K9POMC-4), обграждащи мутацията в центъра на ампликона, което улесни RFLP анализа. Разлика в дължината на ампликон, малка от 14 двойки основи, може да бъде трудно разрешима чрез електрофореза в агарозен гел, особено при хетерозиготи; поради това последователностите от див тип и делта-екзон 3 също бяха изследвани за диференциални рестрикционни ензимни места за рязане. За тази цел бяха тествани два рестрикционни ензима, ApaI и SacII. ApaI беше предсказано да наряза дивия продукт на 4 фрагмента (211, 131, 107 и 85 bp), но ще намали алела delta-exon 3 само на 3 фрагмента (282, 131 и 107 bp). Предвиждаше се, че SacII ще наряза дивия продукт на 4 фрагмента (214, 185, 116 и 19 bp), но ще намали алела delta-exon 3 само на 3 фрагмента (385, 116 и 19 bp). Електрофорезата с агарозен гел потвърждава тези RFLP профили (Фигура 4) с хетерозиготни кучета, показващи характерна тройна лента, поради образуването на ДНК хетеродуплекс. Използвайки стандартна PCR, ApaI/SacII смилане и електрофореза в агарозен гел, 11 кучета с диабет и 11 контролни кучета бяха скринирани за мутация на делта-екзон 3, демонстрирайки, че този подход позволява генотиповете да бъдат точно идентифицирани.

(A) Агарозна гел електрофореза на продукти с полимеразна верижна реакция (PCR) след амплификация на 534 базисни двойки фрагмент от кучешкия POMC ген при 6 кучета лабрадор ретривър (C4, C9, D2, D3, D7 и D10). Комбинацията от ниско напрежение, високо съдържание на агарозен гел и продължително време позволява отделяне на PCR продуктите от кучета, които са имали хомозиготни (Ho) или хетерозиготни (Het) или диви (WT) генотипове по отношение на 14-базовия двойка POMC изтриване. Тройната лента в хетерозиготите представлява заличения алел, алела от див тип и хетеродуплекс от двата алела. Същите PCR продукти се усвояват с ApaI ензим (Б.) или Sac II ензим (° С) предоставяне на потвърждение на генотипа, тъй като сайтовете за смилане на рестрикционните ензими не присъстват в алела за делеция на POMC.

Използвайки този PCR/RFLP анализ, диабетните и недиабетните лабрадор ретривъри са генотипирани за мутацията на делта-екзон 3, резултатите от които са обобщени в таблица 2. Малката алелна честота на мутацията в общата популация на всички 118 кучета е 0,207. Не е установена значима връзка между наличието на алел POMC делта-екзон 3 и диагнозата DM в тази популация от лабрадор ретривъри.

Таблица 2

Данни за генотипа за 61 недиабетни и 57 диабетични лабрадор ретривъри за мутацията на POMC делта-екзон 4 и хи-квадрат анализ на разпределението на алелите между 2-те популации

POMC Delta ‐ Exon 3 Генотип Кучета за контрол Диабетни кучета Всички кучетаObservaExpectedChi ‐ SquaredObservaExpectedChi ‐ Squared
Див тип3538.250,283935,750,374
Хетерозиготна делеция2420.160,731518.840,7839
Хомозиготна делеция22.580,1332.420,145
Обща сума61 57 118

Статистиката за хи-квадрат е 2,36. P-стойността е .31. Резултатът е незначителен при P 3 B), с потенциално въздействие върху експресията на бета липокортин, бета меланоцит-стимулиращ хормон и бета ендорфин.

RFLP анализът, извършен в това проучване, потвърждава премахването на местата на разцепване както на ензима ApaI, така и на ензима SacII чрез делецията на делта-екзон 4 POMC и позволява валидиране на проста стратегия за генотипиране на POMC, базирана на PCR и електрофореза в агарозен гел.

Резултатите от генотипизиране 61 контрола и 57 диабетични лабрадор ретривъри не показват никаква връзка между делецията на делта-екзон 3 POMC делеция и чувствителността към DM. Има няколко възможни причини за това, включително наличието на фенокопии на болести в тази популация, потенциално разнообразния генетичен произход на кучета, които не са родословни, идентифицирани от техните собственици като лабрадор ретривъри или възможността рискът от диабет при лабрадор ретривърите да се дължи на широк набор от гени, всеки с малки ефекти.

Заключения

Това проучване не открива доказателства, че честото изтриване на POMC 14-двойка при лабрадор ретривъри, за което се съобщава, че е свързано със затлъстяване и апетит, е свързано с риск от DM при тази порода. Събирането на събития в кучешкия POMC ген не е напълно изяснено, но изтриването вероятно ще доведе до изместване на рамката в протеина. Генотипирането на мутацията въз основа на полиморфизъм, базиран на рестрикционен фрагмент, може да се извърши бързо и точно, използвайки PCR, ApaI или SacII ензимно разграждане и електрофореза в агарозен гел. Това проучване добавя към масива от доказателства, които подкрепят основа за DM при лабрадорския ретривър, който не е задвижван от затлъстяване.

Благодарности

Авторите благодарят на А. Хъгинс за съдействието при екстракцията на ДНК и ветеринарните хирурзи, които предоставят проби в базата данни и архива на кучешкия диабет в Обединеното кралство. LJD беше подкрепена с безвъзмездна помощ от Ветеринарната докторантска стипендия на Wellcome Trust, но не беше получено конкретно финансиране за това проучване.

Декларация за конфликт на интереси: Авторите не декларират конфликт на интереси.

Извънкласна антимикробна декларация: Авторите декларират, че не са използвали антимикробни средства извън етикета.

Бележки

Базата данни и архив на кучешкия диабет в Обединеното кралство получи подкрепа от благотворителния тръст на британския киноложки клуб и MSD.

Този документ не е представен на нито едно заседание.

Бележки

1 Qiagen, Хилден, Германия

2 Nanodrop, Wilmington, DE

3 Coralville, IA

4 Bio-Rad, Херкулес, Калифорния

5 NEB, Ipswich, MA

6 реагент за секвениране BigDye 3.1, Thermo Fisher, Пейсли, Великобритания