Дизайн на изследването за ремисия на безалкохолен стеатохепатит (NASH), медиирана от докозахексаенова киселина (DHA), при мъжки Ldlr -/- мишки. Чернодробни проби, използвани в този липидомичен анализ, са получени от предварително публикуваното ни проучване, оценяващо способността на DHA да стимулира ремисия на NASH [52]. Накратко, мишките на възраст 10 седмици са хранени с диета с чау (Purina Pico Lab диета 5053) и са служили като референтна диета (RD). RD групата се поддържа на RD по време на проучването, т.е. 30 седмици (седмици; RD30, брой животни (N) = 5). Мишките също бяха хранени със западната диета (WD) (Research Diets, D12079B) в продължение на 22 седмици. На 22 седмици група мишки, хранени с WD, бяха евтаназирани за възстановяване на кръв и черен дроб. Тази група (WD22, N = 5) служи като базова линия за прогресиране на заболяването. Останалите WD-хранени мишки бяха превключени на WD, допълнена със зехтин (WDO30, N = 6) или DHASCO (WDD30, N = 7) и евтаназирани 8 седмици (8 седмици) по-късно. Вижте Материали и методи за повече подробности.

липидомичен

Диетични ефекти върху мембранните липиди. (А): Кумулативен индекс на насищане на липидите във всеки липиден клас. Индексът на насищане (SI) се изчислява, както следва: един минус (брой двойни връзки), разделен на (брой мастни ацилни въглероди минус един). Кумулативният индекс на насищане се изчислява чрез умножаване на SI по пиковата интензивност на всеки липиден вид и сумиране на всички липиди във всеки липиден клас. (B): Ефект на диетата върху кумулативния индекс на насищане за всеки липиден клас. Резултатите са представени като кратна промяна, средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM); *, q q q-стойност е коригирана p-стойност на скоростта на фалшиво откриване (FDR)].

Анализ на основните компоненти на диетичните ефекти върху чернодробните липиди. Всички данни за липидите, събрани за това проучване и предишното ни проучване [52], са използвани при този анализ. Данните включват метилови естери на мастни киселини, съобщени по-рано [52], и всички мембранни липидни и оксилипинови данни, получени съответно от UPLC-MS/MS и HPLC-dMRM анализ. Анализът на основния компонент беше извършен с помощта на статистическия пакет в Metabolanalyst 4.0 [66].

Топлинна карта, илюстрираща диетичните ефекти върху най-добрите 25 липидни характеристики. Както на Фигура 3, всички липидни данни са използвани за извършване на ANOVA (еднопосочна) и е изградена топлинна карта, използвайки статистическия пакет в характеристиките на Metabolanalyst [66]. 25-те най-важни липидни характеристики са илюстрирани в топлинната карта. Стойността на q за всеки липид е в лявата страна на топлинната карта. В колоните вдясно са изброени конкретни липиди във всеки липиден клас, които са били на топлинната карта. Стрелките показват ефекта от диетата WDO30 и WDD30 в сравнение с групата RD30 (увеличаване, намаляване, без промяна (NC)) (WD, допълнена със зехтин (WDO) или DHASCO (WDD)).

Обобщение на WD и DHA ефектите върху чернодробните оксилипини, получени от ω6 PUFA (A) и ω3 PUFA (B). Диаграмите илюстрират пътя за превръщане на диетичните есенциални мастни киселини в C18-22 PUFA и превръщането на PUFA в оксилипини. Пътищата са модифицирани от пътища, публикувани от Gabbs et al. [61]. Оксилипините, подчертани в синьо, представляват оксилипини, които са определени количествено чрез LC/MS или газова хроматография (Фигура 5 и Фигура 6). Ензимите, участващи в метаболизма на оксилипина, са в сиви кутии (Фигура 7). Червените и зелените стрелки се използват за представяне на ефектите (увеличаване; намаляване) на WDO спрямо RD30 (червени стрелки) и WDD30 спрямо RD30 (зелени стрелки) върху чернодробното изобилие от мастни киселини, оксилипини и транскрипти, участващи в метаболизма на PUFA и оксилипините. Тънките и дебели стрелки представляват съответно слаб и силен отговор на диетата. EFA: незаменими мастни киселини; ROS, реактивни кислородни видове. Прищявки, десатураза на мастни киселини; Elovl, елонгаза на мастни киселини; pβOx, пероксизомално β-окисление; COX, циклооксигеназа; ALOX, арахидонова липоксигеназа; CYP, цитохром P450, Ephx1, микрозомална епоксидна хидролаза; Ephx2, разтворима епоксидна хидролаза.

Резюме

1. Въведение

93 милиона възрастни [10] и

14 милиона деца [11] в САЩ са със затлъстяване. Като такива, както затлъстелите деца, така и възрастните са изложени на риск от развитие на NAFLD [12]. Начинът на живот, диетата, генетиката и ендокринният статус допринасят за появата на NAFLD и прогресирането му до неалкохолен стеатохепатит (NASH), цироза и първичен хепатоцелуларен рак (HCC) [7,13]. Освен това NAFLD е рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания [14,15,16]. Основните четири рискови фактора за NAFLD са затлъстяване, T2DM, дислипидемия и метаболитен синдром [17,18].

2. Резултати

2.1. Влияние на западната диета (WD) върху мембранните липиди

2.2. Диетични ефекти върху чернодробните неестерифицирани оксилипини

50% от WD. Само експресията на Cyp2c29 беше частично възстановена чрез добавяне на DHA към диетата. Нито WDO, нито WDD са повлияли експресията на подтипове Cyp2J или Ephx.

2.3. Асоциации между чернодробни липиди и NASH маркери за възпаление и фиброза

2.3.1. Възпаление

2.3.2. Фиброза

3. Дискусия

4. Материали и методи

4.1. Дизайн на изследване за медиирана от DHA ремисия на NASH при мъжки Ldlr -/- мишки

40% от общите ацилни вериги в DHASCO и DHASCO не съдържат EPA, DPA (22: 5, ω3), ARA или LA [50]. DHA присъства в диетата при 2% от общите калории (WDD30, n = 7). За да има изокалорични диети, към диетата на WD се добавя зехтин, т.е. WDO30. Групите WDO30 и WDD30 бяха поддържани на съответните им диети в продължение на 8 седмици. След това мишките се гладуват цяла нощ и се евтаназират за събиране на черен дроб и кръв. Всички проби се съхраняват при -80 ° C, докато се използват за екстракция. Дизайнът на това проучване позволява оценка на прогресията на заболяването от 22 до 30 седмици и способността на DHA да повлиява прогресията на заболяването (Фигура 1).

4.2. Екстракция на РНК и qRTPCR

4.3. Подготовка на пробата за липидомичен анализ

20–25 mg) се прехвърля в 2 ml предварително претеглени полипропиленови епруветки, съдържащи керамични топчета и студен L-MS клас метанол (240 μL). Деутерирани стандарти за възстановяване на липиди (5 μL Splash ® Lipidomix ® Mass Spec Standards (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) бяха добавени към всяка проба. Пробите бяха хомогенизирани в хомогенизатор на основата на мъниста Precellys ® 24 за 2 минути при 1350 об/мин. Към пробите се добавя студено MTBE (750 μL), последвано от завихряне (10 s) и разклащане (6 минути) при 4 ° C. Фазовото разделяне се предизвиква чрез добавяне на вода с клас LC-MS (188 μL), последвано от завихряне и центрофугиране (14 000 оборота в минута, 2 минути). Горната органична фаза (300 μL) се извлича и се изпарява с помощта на Labconco центровап вакуумен концентратор (Канзас Сити, МО, САЩ). Изсушени липидни екстракти се суспендират отново в метанол/толуен (9: 1, v/v, 100 μL) смес, съдържаща CUDA (1-циклохексил уреидо, 3-додеканова киселина, 50 ng/ml; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) като допълнителен вътрешен стандарт. Пробите бяха завихрени (10 s) и се центрофугира (14 000 rpm, 2 min) преди LC-MS/MS анализ.

4.4. Подготовка на пробата за анализ на оксилипини

4.5. Хроматографски и масспектрометрични условия за анализ на липиди и оксилипини

4.5.1. Нецелена липидомика

35 000 пълна ширина при половин максимум (FWHM)) и в режим с висока чувствителност (

15 000 FWHM) в MS 2. Последователното събиране на прозорци на всички теоретични фрагмент-йонни спектри (SWATH) в режим с положителен/отрицателен йон беше използвано като система за независима от данните (DIA) система за събиране на данни за всички проби. Използвано е придобиване на данни (DDA) на отделна проба от пул за контрол на качеството (QC), за да се проверят анотациите от събирането на SWATH за най-разпространените липидни видове. Подробна информация за условията на SWATH, включени в Допълнителна информация, озаглавена SWATH параметри за нецелеви анализ.