Субекти

Измерването на това колко яде една плодова муха отваря вратата за изследвания на метаболизма и стареенето. Но анализите се обсъждат горещо.

Учените могат да избират от множество анализи, за да измерват колко ядат плодовите мухи. Такива измервания са необходими за експерименти върху метаболизма, циркадните ритми, стареенето, социалното поведение, пристрастяването или невроналната основа на храненето. Природни методи провери с няколко учени за плодни мухи за силните и слабите страни на тестовете за хранене.

„Те са неприятност“, казва изследователката на плодовите мухи Линда Партридж относно създаването на тестове за хранене. „Трудно е да се направят тези измервания.“ Партридж има лаборатория в Университетския колеж в Лондон и също така основава Института по биология на стареенето „Макс Планк“ в Кьолн, Германия, където сега прекарва по-голямата част от времето си. Извършването на измерванията е необходима неприятност, казва тя, тъй като данните позволяват да се обърне внимание на много биологични въпроси, като например как приемът на храна влияе върху продължителността на живота 1, поведението, метаболизма или броя на яйцата, които женската снася.

Мухите са се превърнали в модел, с който да изследват и дисектират сложно поведение като циркадна активност, сън и поведение при хранене, казва Уилям Джа, изследовател от кампуса на Изследователския институт на Скрипс във Флорида. Необходими са анализи за разрешаване на количеството изядена храна и разликите в храненето, особено за експериментални анализи на сложно поведение.

Когато правят експерименти, биолозите могат да дадат на някои мухи диета с високо съдържание на протеини, а на други мухи с диета с високо съдържание на захар, а данните могат да покажат, че диетата с високо съдържание на протеини намалява продължителността на живота. Но заключението може да се окаже погрешно, ако измерванията разкрият, че мухите всъщност ядат еднакво количество протеин и в двете диети, казва Гил Карвальо, който е постдокторант в Института за мозък и творчество в Университета на Южна Калифорния. Завършил е докторска работа в лабораторията на Seymour Benzer в Калифорнийския технологичен институт, където Ja е бил докторант.

метаболизъм

Почти всеки фактор, за който е известно, че влияе на стареенето, е пряко или косвено свързан с храненето, казва Карвальо. Експериментите за стареене могат да разгледат ефекта от диетичните ограничения и други манипулации с храна, инсулиновия път или други пътища, участващи в метаболизма. Мутиралите мухи могат да покажат явни или фини промени в хранителното поведение, метаболизма или моделите на сън. Неадекватните тестове за хранене могат да доведат до заключения, които потенциално могат да заблудят други изследователи, редактори и рецензенти, така че да се обърне внимание на храненето, когато не е, казва той.

Съгласие е относно важността на тези анализи. Има обаче енергична дискусия - може дори да се нарече борба с храна за плодови мухи - за плюсовете и минусите на всеки метод.

Измерването на поведението на храна и поведението при хранене е труден проблем и много учени са недоволни от възможностите и продължаващите дискусии за методите, казва Скот Плетчър от Университета в Мичиган, който беше постдокторант в лабораторията на Партридж. „Надявам се, че това се променя“, казва той, особено сега, когато нараства интересът към неврологичната общност да изследва сложни поведения с помощта на мухата. Тези измервания ще помогнат за изследване на сложните механизми за контрол на мозъка на мухата и ще позволят на учените да проучат връзките между поведението, метаболизма и стареенето.

Багрила и трасиращи вещества

Етикетирането на храни с радиоактивни маркери или оцветители отдавна е практика в лабораториите за плодови мухи за измерване на обема на приема на храна 2,3. Материалите, които остават в мухата, могат да бъдат измерени. Но те не остават в тялото на мухата завинаги: мухите се отделят.

Мухите започват да дефекират около 45 минути след приема на храна, на което изследователите трябва да се вслушат и което може да им помогне да калибрират техния анализ на хранене въз основа на етикета. „Това е много работа“, казва Плетчър. За малък брой мухи тези радиомаркиращи анализи работят, но не е лесно да има стотици хиляди радиоактивни мухи в лабораторията. Също така, някои мухи може да запазят повече радиомаркировка, докато други може да го отделят по-бързо, казва той. Подробностите за усвояването на радиомаркировка в муха не са добре разбрани.

Променливостта на радиомаркировките ще зависи от типа етикет, казва Джа. Различни молекули могат да бъдат етикетирани - захар или дезоксицитидин трифосфат (dCTP) например - и могат да се използват различни атоми, като 14 C или 32 P. 14 C от радиомаркирана захароза може да се метаболизира бързо и да се „издиша“ като CO2. Но Ja и неговата група тестваха dCTP, етикетиран с радиоактивен фосфор ([32 P] dCTP), и установиха, че 90% от етикета се задържа за 24-часов период, което го прави измерим и разумен отразяване на приема на храна, казва той. Не е ясно как някой от тези етикети се метаболизира, но важното за анализа на храненето е какво се задържа в тялото на мухата и е измеримо. Радиоактивните етикети, казва той, все още са по-добри за измерване на „истинската консумация“ от багрилата.

За разлика от радиоактивните проследяващи вещества в храната, багрилата не се абсорбират от червата и веднага щом започне дефекацията, измерването започва да бъде неточно, казва Карвальо. Хранителните навици също влизат в сила. Мухите могат да изминат няколко часа, без да ядат, което означава, че произволен 15-минутен прозорец за измерване може да показва, че не се яде изобщо. Въпреки че е работил с багрила като аспирант, той казва, „бързо стана ясно, че боите просто не са достатъчно добри, ако искате сериозна мярка за хранене.“

Боите са чудесен начин да се определи дали мухите имат ясни предпочитания към една храна, казва Плетчър. Експериментатор може да пожелае да види дали мухите предпочитат чиста захар - с етикет синя, например - или чиста мая - с червено. Тестовете за боядисване са бързи и много мухи, включително специфични мутанти на мухи, могат да бъдат скринирани. Ако обаче мухите нямат почти 100% предпочитание към храна, казва Плетчър, „тогава изведнъж се опитвате да разберете дали коремът е някак червен, но лилав - или е син, но лилав? - така че няма разделителна сила. "

И двата метода за етикетиране включват маркер за храна и ключовата характеристика е да се измери каква част от маркера се задържа в тялото за определен период от време, казва Джа. И двата метода вероятно предоставят данни, близки до перфектни, ако периодът от време на измерване е 10-15 минути, което е преди екскрецията да започне и преди повечето хранителни вещества да се метаболизират и впоследствие да се загубят. При тестваните багрила екскрецията започва 15–30 минути след приема и 100% задържане започва да спада. При радиоизотопите вариабилността също ще зависи от използваната молекула и атома, който е маркиран.

Както багрилата, така и радиомаркировките изискват бързи измервания, в противен случай съществува риск да се измери само капацитетът на червата на мухата или нивата на хомеостаза, казва Партридж. Проблемът с багрилата е, че прехвърлянето на мухи към боядисана храна вероятно ги безпокои. Първоначално мухите ще изследват новата си хранителна повърхност, казва тя. „Ако имате късмет, те се установяват и хранят доста бързо, но можете да направите само много бързо измерване.“

Има много променливи. Околната среда на мухата може да повлияе на нейния метаболизъм, казва Карвальо. Хранителните вещества не се усвояват произволно и учените проучват как да определят кои хранителни вещества се абсорбират и в коя тъкан. „Анализът на изотопа позволява да се разгледа първо това, но остават всякакви интересни допълнителни въпроси“, казва той.

Анализът CAFE е тест за капилярно подаване, който Ja разработи съвместно 4. В този анализ мухите пият течна храна от епруветка, висяща отгоре на флакона, и измерването е колко течност напуска тръбата. CAFE изглежда е най-широко използваният и приет подход в момента, казва той, тъй като повечето лаборатории изглежда избягват да използват радиация.

Анализът CAFE може директно да измерва усвояването на храна, казва Джа. Но за да се уверят, че резултатите са стабилни, изследователите могат да валидират CAFE резултатите с радиоизотопно маркиране 5. Абсолютните нива на хранене може да са различни поради разликите между течна храна и твърда храна, например. Но ако относителните резултати са сходни, като например при тестване дали мутантна затлъстела муха преяжда спрямо контролната муха и в двата анализа, изследовател може по-уверено да каже, че „мутиралата затлъстела муха яде повече от контрола“, казва Джа.

Яденето на течна храна за повече от седмица не е здравословно за мухите, но този тип анализ позволява на изследователите да правят измервания в продължение на няколко дни, казва Джа. Използването на теста не трябва да бъде твърде кратко, казва той. Някои групи използват анализа само за няколко часа, за да изследват разликите между контрола и мутантна муха. Това е твърде кратък период от време, за да се видят разликите в храненето или приемането на калории.

Джа сега тества автоматизирана версия на теста CAFE, който той и неговият екип са изградили, в който камера заснема поведението на хранене в тръбите и която те изпращат в други лаборатории да опитат. Той иска да използва този анализ за изследване на гени, свързани с поведението на хранене, за да идентифицира невронната верига, свързана с това поведение. Други лаборатории също изграждат автоматизирани версии на този анализ, казва той.

Carvalho харесва, че CAFE анализът избягва убиването на животните при всяко измерване и че може да се използва за няколко дни и повече. Освен това се избягва необходимостта от етикетирана храна и той го намира лесен за използване, казва той. Анализът изисква течна храна, която е за разлика от твърдата храна, използвана в повечето лаборатории, но има експериментално предимство. „Можете да превключвате храни, без да безпокоите животните“, казва той.

Критиците на теста CAFE посочват, че мухите трябва да се хранят в обърнато положение, за да пият от тубата. Джа казва, че той и екипът му са разгледали проблемите, които това може да причини, и са установили, че мухите все още показват типичните си циркадни ритми, като например да ядат повече през деня, отколкото през нощта. Анализът „определено изглежда различно от стандартния лабораторен флакон и винаги трябва да прецените дали това е важно съображение за това, което изучавате.“

„Това е много точна мярка за това колко много се отделя от тръбата“, казва Плетчър за анализа на CAFE. Неговата слабост, казва той, е поведението, необходимо на мухите, за да стигнат до тръбата. „Те просто не могат да стигнат до храната, когато остареят“, казва Партридж. „Те се нуждаят от равна повърхност, до която лесно да имат достъп и да застанат.“ Според тези изследователи това означава, че това не е тест, с който да се измери връзката между поведението на хранене и продължителността на живота.

Изучаването на стареенето при плодовите мухи е трудно, тъй като животът им в дивата природа не е известен. Изследователите обикновено се съгласяват, че продължителността на живота е около един месец в дивата природа. Но стареенето се случва бързо, казва Партридж. Дори на две седмици мухите не са толкова подвижни, колкото когато се появяват за първи път от какавидата си. „Локомоторното увреждане идва наистина доста бързо“, казва тя.

Един от начините да се прецени дали анализът променя поведението е да се провежда CAFE паралелно с друг анализ, който не включва висяща капиляра с течна храна, казва Карвальо. Експериментаторът ще иска да използва същите мухи и същите хранителни компоненти. „Ако CAFE причини промени в поведението, които засягат храненето, ще видите разлика между двата анализа“, казва той.

Разширение на хобот

Различен клас анализи измерва разширението на мухата на мухата. Разработен в лабораторията на Партридж, този подход измерва поведението, свързано с храната, и е непряка мярка за консумация на храна 6 .

Плетчър е разработил тест в този клас, наречен мухомер за взаимодействие течност и храна (FLIC), който дава на други лаборатории, за да опитат 7. FLIC е набор от кладенци за хранене, заобиколени от електронна подложка. „Когато мухата застане на подложката и залепи хоботчето си в храната, получаваме сигнал“, казва Плетчър. Софтуерът събира, обработва предварително и след това изпраща данни към настолен компютър за допълнителен анализ и визуализация.

Анализът проследява сигнали от 50 микросекунди и измерва непрекъснатото взаимодействие на муха с храната. Въпреки че не е пряка мярка за консумация, казва Плетчър, тя може да се комбинира с радиоизотопи или багрила за събиране на информация за усвояването на храна. И може да помогне за анализ на поведението при хранене, като циркадни ритми и взаимодействия с храната във времето.

Друг анализ на поведението при хранене, мухомор и детектор на активност (flyPAD), разработен от Карлос Рибейро и неговия екип в Центъра за непознати Champalimaud и от Майкъл Дикинсън и неговата група от Университета във Вашингтон, също проследява взаимодействието на мухите с храната им 8 (Дикинсън сега е в Калифорнийския технологичен институт). Под съд за храна има електрод, а зоната около храната е оборудвана с друг електрод. Когато мухата докосне храната или с хобот, или с крак, промяната в капацитета води до откриваем сигнал. Екипът разработи софтуер за анализ на тези сигнали за изчисляване на приема на храна.

Разширението на хобот отразява мотивацията на мухата да се храни, казва Плетчър. Мухата може да е гладна и първо да използва множеството вкусови рецептори на хобота си, за да тества храната. „Ако има добър вкус, скоростта на удължаване на хобот ще се увеличи“, казва той. Мухите също имат сензорни рецептори на краката си. Колкото по-благоприятна е средата, толкова по-често една муха ще разширява хоботчето си.

И удължаването на хобот е част от други поведения все още: женска муха може да души за феромони на други мухи, за да види дали други жени могат да имат снесени яйца на дадено място, казва Партридж. Знаейки дали там има ларви, това ще обезсърчи снасянето на яйца, защото тези други ларви ще изядат новите яйца. Мухите също могат да се хранят за микроорганизми, казва тя.

„Понякога може просто да взема проби от околната среда и всъщност да не приема храна или да не отнема много“, казва Партридж за удължаването на хобот. За да накара анализът да предостави данни за усвояването на храна, тя препоръчва експериментаторът също да използва багрила и да измерва за период от 45 минути. Групите могат да бъдат сравнени чрез съотнасяне на количеството удължаване на хобот с количеството усвояване на багрилото. Когато правят по-дългосрочни измервания, изследователите могат да калибрират метода на удължаване на хобот с данни от анализа на багрилото, казва тя.

„Това със сигурност е интересно поведение, но да го използвам като заместител за прием на храна?“ казва Джа, „Добре, ако това е единственият наличен тест - но вече не, според мен.“

Разширението на хобот, CAFE или други анализи са добре, казва Карвальо, ако изследователите оценяват взаимодействията на мухите с храната. Но според него има твърде много объркващи фактори, когато се използва удължаване на хобот, за да се направи извод за обема на приема на храна.

Едно предизвикателство при всички анализи, казва Плетчър, включително неговия анализ, CAFE, багрила и радиомаркировки, е, че няма златен стандарт, който да ги сравнява. „Когато те не са съгласни, ние нямаме никакъв обективен стандарт, който да ги сравнява, за да кажем кой е прав и кой греши, или кой е по-близо и кой е по-далеч“, казва той. Според него все още не е намерен идеалният анализ, с който да се измери обемът на приеманата храна.

При избора си на анализ, казва Джа, учените трябва да вземат предвид приложението и контекста (Таблица 1). Той смята, че CAFE анализът е най-подходящ за измерване на количеството прием на храна, докато останалите анализи могат да се използват за измерване на поведението, свързано с храната. "Така че, ако се интересувате повече от някое от тези други поведения, тогава трябва да използвате подходящия тест", казва той.

Любими храни

Един аспект, който влияе върху храненето на плодовите мухи, е самата храна. Рецептите и хранителните съставки се различават в различните лаборатории и, казва Партридж, „подозирам, че това е адски мухи.“ Повечето рецепти включват захар и мая, а някои включват царевично брашно, което се добавя за промяна на вискозитета на храната, което прави храната по-мека за мухите. Но храната може да включва съставки като валцуван овес, банани или малц.

През 2013 г. Партридж и Плетчър, заедно с колегите си във Великобритания, Португалия и Китай, разработиха холидна среда, тоест летяща храна с напълно химически дефинирани съставки 9. „Можете да го направите напълно повторимо в различни лаборатории, защото това са само химикали - все едно да приготвите буферен разтвор или нещо друго“, казва Партридж. Но от гледна точка на мухата, казва тя, тя не е естествена храна, точно както по-голямата част от храната за мухи, използвана в лаборатории. В дивата природа мухите няма да ядат толкова захароза, колкото в лабораторията и ще ядат микроорганизми и диви дрожди.

„Има малко противоречия относно маята“, казва Плетчър. Много лаборатории използват бирена мая, докато други използват екстракт от мая, който е изчерпан от много хранителни вещества. Мухите откриват разликата, казва Партридж, „и мразят екстракта от дрожди“.

Понякога напълно химически дефинираната диета е умна, казва Джа, но в други ситуации връщането към „добрите стари дрожди“ е правилно. Изглежда, че дрождите съдържат една или няколко съставки, които влияят на метаболизма на мухите и учените все още не са разбрали тази връзка. Химически дефинираната диета от лабораторията на Партридж е „най-близкото до достигане на пълното здраве и плодовитост на мухите и това определено е впечатляващо постижение“, казва той.

Когато кариерата на учените ги превежда от една лаборатория в друга, те вземат рецептите си със себе си, казва Плетчър. Когато за първи път стартира лабораторията си, той се опита да накара общността да се съгласи за храна за мухи. "Това просто не работи", казва той. „Хората са обвързани с рецепта.“ Това е разбираемо, като се има предвид, че промените в диетата могат да черпят данни от минали експерименти под въпрос, казва той.

Докато учените научават все повече за това кои диетични компоненти са най-подходящи за мухи, диетите с плодови мухи в лабораториите са се сближили, казва Плетчър. Като цяло има по-малко рецепти и те обикновено имат два основни компонента: някаква форма на захар и мая.

С диета и анализи: „Не мисля, че има грешен начин“, казва Джа. „Просто трябва да сте честни относно това, което правите, и да бъдете изключително внимателни как в крайна сметка контролирате и интерпретирате вашите собствени експерименти.“

Всички техники са потенциален компромис, казва Партридж, между възможността за точно измерване на приема на храна и поставянето на мухата в изкуствена или дори вредна среда, която рискува да обезсмисли измерванията. Не е толкова много, че има различни анализи за различни въпроси, а по-скоро, казва тя, „за различни въпроси можете да избягате с различни анализи“.

Препратки

Grandison, R.C., Piper, M.D. & Partridge, L. Природата 462, 1061–1064 (2009).

Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T. & Shimada, I. J. Comp. Физиол. A 147, 433–437 (1982).