Молекулярен вроден имунитет

Редактиран от
Лиу Ли

Вирджиния Тех, САЩ

Прегледан от
Мин Ву

Университет на Северна Дакота, САЩ

Джоан Клария

Болница Клиник де Барселона, Испания

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

хиперполяризацията

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • Отдел за възпаление и имунитет, Алкохолен център в Северна Охайо, Център за изследване на чернодробните заболявания, Клиника Кливланд, Изследователски институт Lerner, Кливланд, Охайо, САЩ

Въведение

Свързаното с алкохола чернодробно заболяване (ALD) е водещата причина за чернодробни нарушения и допринася за 25% от свързаните с алкохола смъртни случаи в целия свят (1, 2). ALD се характеризира с прогресивна чернодробна стеатоза, фиброза и цироза; алкохолен хепатит (AH), остро възпалително състояние, може да възникне във всяка точка от спектъра на заболяването и при тежка AH има висок процент на краткосрочна смъртност (3). Докато причините за АХ са неизвестни, консумацията на алкохол увеличава пропускливостта на червата, което води до транслокация както на микроби, така и на микробни продукти, включително липополизахарид (LPS), β-глюкан и други свързани с патогени молекулни модели (PAMPs), в порталната циркулация, активирайки вродени имунни отговори в черния дроб (4, 5).

Първите имунни клетки, които реагират на тези PAMP, са клетките на Kupffer, резидентният макрофаг в черния дроб (6, 7). Хроничната експозиция на етанол сенсибилизира клетките на Kupffer към активиране от PAMPs, което води до изострени противовъзпалителни реакции (6–8). Про- и противовъзпалителните отговори на макрофагите могат да бъдат повлияни от тяхното поляризационно състояние (9). Поляризацията на макрофагите е спектър от активиращи състояния, въпреки че малко се знае как функционират тези различни фенотипове in vivo и на индивидуално клетъчно ниво. Инвитро изследвания на поляризацията се фокусират върху фенотипите, генерирани от излагане на специфични активиращи сигнали, като LPS/IFNγ-индуцирана M1 (провъзпалителна) поляризация и IL-10 или IL-4 индукция на специфични видове M2 (противовъзпалителни) поляризирани макрофаги . Поляризацията обикновено се характеризира с експресия на маркери на клетъчната повърхност, които предизвикват различни про- и противовъзпалителни ефекти, включително CD86 (M1) и CD206 (M2) (10, 11).

miRNAs са малки некодиращи РНК, които регулират генната експресия чрез свързване с mRNAs и инхибиране на транслацията. Те се транскрибират като pri-miRNA чрез 2 механизма: като (1) единични транскрипционни единици или (2) ко-транскрибират и обработват от интрона на иРНК на гостоприемника. След това pri-miRNAs се обработват в две зрели miRNAs, -5p и -3p (18, 19). Малките РНК-секвениране и микрочипове от M1 и M2 поляризирани макрофаги, както и неполяризирани моноцити, разкриха динамично регулиране на поляризацията от десетки miRNAs (20). Наскоро работата на нашата група и други установи, че miRNAs играят важни регулаторни роли в отговор на етанола (17, 21–24). miR-181b-3p беше регулиран надолу в клетки на Kupffer, изолирани от хронични плъхове, хранени с етанол, което води до повишено регулиране на сигнализирането на импортин α5 и NFκB. miR-155 се експресира в клетки на Kupffer, изолирани от мишки, хранени с етанолова диета, и загубата на miR-155 отслабва отговора на LPS (23-25). miR-27a се предизвиква от остра консумация на алкохол при хора и измества макрофагите към поляризация на М2 (17).

Материали и методи

Малко РНК-секвениране на клетки на Kupffer, изолирани от подхранвани с етанол плъхове

Алкохолен хепатит и здравословен контрол на пациента

Записаните пациенти са имали потвърдена диагноза алкохолен хепатит от клиницисти в клиниката в Кливланд и университетските болници, Кливланд, въз основа на медицинска история, физически преглед и лабораторни резултати, съгласно насоките на Американския колеж по гастроентерология [https: // gi. org/клинични насоки /]. Здрави контролни субекти бяха наети от звеното за клинични изследвания в клиниката в Кливланд. Протоколът за проучване е одобрен от Институционалния съвет за преглед на защитата на човешките субекти в научните изследвания в клиниката в Кливланд и университетските болници, Кливланд. Всички методи са извършени в съответствие с указанията и разпоредбите на IRB и е получено писмено информирано съгласие от всички субекти.

Изолиране на човешки PBMC

Изолирането на PBMC от човешка кръв се извършва чрез центрофугиране с градиент на плътността на Ficoll-Paque PLUS. Накратко, 1 ml прясно събрано Buffy Coat се смесва в съотношение 1: 5 (обем/обем) с PBS при 37 ° C и сместа се разделя и наслоява върху 8 ml Ficoll-Paque PLUS в две 15 ml конични центрофужни епруветки . След центрофугиране при 400 × g в продължение на 30 минути при 20 ° C (без спирачка), фракциите на буфите се събират, обединяват, ресуспендират в хранителна среда (RPMI-1640, допълнена със 100 μM пеницилин-стрептомицин и 10 об.% FBS) и се центрофугират при 400 × g за 15 минути при 20 ° C. Пелетите бяха ресуспендирани в 8 ml хранителна среда, преброени и отново центрофугирани при 400 х g за 8 минути при 20 ° С. След това клетките бяха криосъхранени чрез ресуспендиране в замразяваща среда (50% хранителна среда, 40% FBS, 10% DMSO) при концентрация 1,5 × 106 клетки/мл и оставени да замръзнат бавно до -80 ° С в стиропор контейнер. За дългосрочно съхранение клетките се съхраняват в течен азот. За експерименти, клетките се размразяват при 37 ° С, след което се добавят бавно към 8 мл топла хранителна среда. След центрофугиране при 400 × g в продължение на 8 минути при 20 ° С, клетките се суспендират отново и се култивират в 96-ямкови плаки в овлажнена атмосфера (5% СО2, 37 ° С). След 18 часа клетките се промиват с среда и се предизвикват с 10 ng/ml LPS за още 60 минути.

Изолиране на CD14 + и CD16 + моноцити

Моноцитите CD14 + и CD16 + бяха изолирани от криоконсервирани и размразени PBMCs, използвайки комплекта за обогатяване на човешки моноцити EasySep без изчерпване на CD16 (StemCell Technologies, Кеймбридж, Масачузетс), следвайки инструкциите на производителя с обработка на ДНКаза, за да се предотврати слепването на клетки. След изолирането клетките се култивират в епруветки и се инкубират в продължение на 24 часа преди екстракцията на РНК.

Анализ на последователността, PCA и изчисляване на диференциалното изразяване

Данните за секвениране бяха подравнени с генома на плъх (Rnor_6.0), като се използва Bowtie2 с -много чувствителен-локален настройка (27). Експресията на коментирани miRNAs се определя с помощта на персонализирани perl скриптове. PCA беше извършен в R, използвайки TPM (преписи на милион) преобразувани данни. Диференциалният израз се изчислява с помощта на EdgeR с първоначално отрязване> 0 четения в поне 1/4 от пробите и накрая прекъсване от FDR 0.915 и r * се различават значително от здравите контроли (стр * се различават значително от здравите контроли (стр + и CD16 + моноцити от пациенти с АХ (н = 5) и здравословни контроли (н = 3) измерено чрез qPCR. Стойностите представляват средните стойности ± SEM, като * се различават значително от здравите контроли (стр * се различават значително от здравите контроли (стр + и CD8 + Т-клетки (38).

miRNA клъстерите са координирано изразени

Тъй като гените на гостоприемника регулират експресията на miRNA, ние прогнозирахме, че miRNAs в рамките на един и същ ген на приемник ще имат силно корелирана експресия. Сред miRNAs, диференцирано експресирани в AH, miRNAs от същия клъстер се държат по подобен начин; miR-221-5p и miR-222-5p miRNAs (в рамките на miRNA клъстер 11) бяха увеличени в AH, докато miR-214-5p, miR-214-3p и miR-199a-3p (miRNA клъстер 8) не бяха (Фигури 4А, С).

Наблюдавахме корелация в експресията между клъстерни miRNAs, например, miR-221-5p и miR-222-5p бяха силно ко-експресирани при здрави контроли и пациенти с AH (Фигура 6А). Важна забележка, изразяването на miR-221-5p и miR-222-3p също беше силно корелирано в клетките на плъхове Kupffer, въпреки че miR-221-3p и miR-222-3p не бяха (Фигура 2В).

Фигура 6. Експресията на miRNA в клъстерите е свързана при здрави контроли и пациенти с АХ. (A, C) Scatterplot на log2 трансформира данни за експресия на miRNA от измервания на qPCR. Черен – Здравословен контрол, пациент с червено-АХ. R стойностите са коефициентите на корелация на Pearson, (стр * представляваща значителна корелация (стр * видове и тяхната роля в миелоидните клетки. Кръв. (2011) 118: 3350–8. doi: 10.1182/кръв-2010-10-312454

38. Juzenas S, Venkatesh G, Hubenthal M, Hoeppner MP, Du ZG, Paulsen M, et al. Изчерпателен, специфичен за клетките микроРНК каталог на човешка периферна кръв. Нуклеинови киселини Res. (2017) 45: 9290–301. doi: 10.1093/nar/gkx706

39. Altuvia Y, Landgraf P, Lithwick G, Elefant N, Pfeffer S, Aravin A, et al. Клъстерни и консервационни модели на човешки микроРНК. Нуклеинови киселини Res. (2005) 33: 2697–706. doi: 10.1093/nar/gki567

40. Sakai A, Saitow F, Maruyama M, Miyake N, Miyake K, Shimada T, et al. MicroRNA клъстер miR-17-92 регулира множество функционално свързани калиеви канали с напрежение при хронична невропатична болка. Nat Commun. (2017) 8: 16079. doi: 10.1038/ncomms16079

41. Hildebrand D, Eberle ME, Wolfle SM, Egler F, Sahin D, Sahr A, et al. Hsa-miR-99b/let-7e/miR-125a клъстер регулира стимулиращите рецептора за разпознаване на патогени супресивни антиген-представящи клетки. Преден имунол. (2018) 9: 1224. doi: 10.3389/fimmu.2018.01224

42. Khuu C, Utheim TP, Sehic A. Трите паралогични микроРНК клъстери в развитие и заболяване, miR-17-92, miR-106a-363 ​​и miR-106b-25. Scientifica. (2016) 2016: 1379643. doi: 10.1155/2016/1379643

43. Vigetti D, Deleonibus S, Moretto P, Bowen T, Fischer JW, Grandoch M, et al. Естественият антисенс транскрипт за хиалуронан синтаза 2 (HAS2-AS1) индуцира транскрипция на HAS2 чрез протеин O-GlcNAcylation. J Biol Chem. (2014) 289: 28816–26. doi: 10.1074/jbc.M114.597401

44. Chan J, Atianand M, Jiang Z, Carpenter S, Aiello D, Elling R, et al. Рязане: естествен антисмислен транскрипт, AS-IL1alpha, контролира индуцируема транскрипция на възпалителния цитокин IL-1alpha. J Имунол. (2015) 195: 1359–63. doi: 10.4049/jimmunol.1500264

45. Curtale G, Renzi TA, Mirolo M, Drufuca L, Albanese M, De Luca M, et al. Многостепенно регулиране на пътя TLR4 от miR-125a

let-7e клъстер. Преден имунол. (2018) 9: 2037. doi: 10.3389/fimmu.2018.02037

46. ​​Ким SW, Ramasamy K, Bouamar H, Lin AP, Jiang D, Aguiar RC. МикроРНК miR-125a и miR-125b конститутивно активират NF-kappaB пътя чрез насочване на тумор некротизиращия фактор алфа-индуциран протеин 3 (TNFAIP3, A20). Proc Natl Acad Sci САЩ. (2012) 109: 7865–70. doi: 10.1073/pnas.1200081109

47. Ganan-Gomez I, Wei Y, Yang H, Pierce S, Bueso-Ramos C, Calin G, et al. Свръхекспресията на miR-125a при миелодиспластичен синдром CD34 + клетки модулира активирането на NF-kappaB и подобрява спирането на диференциацията на еритроидите. PLOS ONE. (2014) 9: e93404. doi: 10.1371/journal.pone.0093404

48. Eigsti RL, Судан B, Wilson ME, Graff JW. Регулиране на свързаните с активирането скорости на натрупване на микроРНК по време на диференциация на моноцити към макрофаги. J Biol Chem. (2014) 289: 28433–47. doi: 10.1074/jbc.M114.599316

Ключови думи: алкохолен хепатит, алкохолно чернодробно заболяване, купферни клетки, макрофаги, моноцити, мононуклеарни клетки в периферна кръв, експресия на miRNA, последователност на малки РНК

Цитиране: Kim A, Saikia P и Nagy LE (2019) miRNAs, участващи в хиперполяризацията M1/​​M2, са групирани и координирано изразени при алкохолен хепатит. Отпред. Имунол. 10: 1295. doi: 10.3389/fimmu.2019.01295

Получено: 01 март 2019 г .; Приет: 21 май 2019 г .;
Публикувано: 07 юни 2019 г.

Liwu Li, Virginia Tech, САЩ

Джоан Клария, болница Клиник де Барселона, Испания
Мин Ву, Университет на Северна Дакота, САЩ