Отделение за наука за птицевъдството, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, Съединени американски щати

бактериални

Отделение за наука за птицевъдството, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, Съединени американски щати

Отделение за наука за птицевъдството, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, САЩ, Програма за клетъчна и молекулярна биология, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, Съединени американски щати

Текущ адрес: Американска администрация по храните и лекарствата (USFDA) Център за безопасност на храните и приложно хранене (CFSAN), College Park, Мериленд, Съединени американски щати

Програма за асоциирани клетки и молекулярна биология, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, Съединени американски щати

Партньорство Cobb-Vantress Inc., Силоам Спрингс, Арканзас, Съединени американски щати

Отделение за наука за птицевъдството, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, САЩ, Програма за клетъчна и молекулярна биология, Университет в Арканзас, Файетвил, Арканзас, Съединени американски щати

  • Тиешан Дзян,
  • Рабиндра К. Мандал,
  • Робърт Ф. Уайдман-младши.,
  • Анита Хативара,
  • Игал Певзнер,
  • Младият Мин Куон

Фигури

Резюме

Цитат: Jiang T, Mandal RK, Wideman RF Jr, Khatiwara A, Pevzner I, Min Kwon Y (2015) Молекулярно изследване на бактериални общности, свързани с бактериална хондронекроза с остеомиелит (BCO) при бройлери. PLoS ONE 10 (4): e0124403. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124403

Академичен редактор: Габриел Морено-Хагелсиб, Университет Уилфрид Лорие, КАНАДА

Получено: 6 август 2014 г .; Прието: 13 март 2015 г .; Публикувано: 16 април 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Финансиране за този проект беше осигурено от Cobb-Vantress Inc., Siloam Springs, Арканзас, САЩ. Финансистът предостави подкрепа под формата на заплата за авторско право, но нямаше никаква допълнителна роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Конкретните роли на тези автори са формулирани в раздела „авторски приноси“.

Конкуриращи се интереси: IP е служител на Cobb-Vantress Inc., чиято компания финансира това проучване. Няма патенти, продукти в разработка или предлагани на пазара продукти, които да бъдат декларирани. Това не променя придържането на авторите към всички политики PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

В миналото методите за идентифициране на патогени разчитаха предимно на техники за култивиране, последвани от биохимични тестове, използващи полуавтоматизирани платформи в клиничната лаборатория [11]. Независими от културата подходи като молекулярно профилиране на 16S rRNA генни последователности предоставят мощна техника за цялостен анализ на структурата и разнообразието на микробните общности [12]. Генните последователности на 16S rRNA съдържат хиперпроменливи региони, които могат да предоставят изчерпателна информация за бактериалните съобщества, включително разнообразие, състав и структура на общността [13]. Разработването на секвенции от следващо поколение, 454 пиросеквенции, платформи SOLID и Illumina, осигуриха голям напредък, като позволиха да бъдат събрани стотици хиляди последователности от множество проби. Тази мощна техника е използвана за изследване на състава на сложни микробни съобщества в различни среди [14–18]. Двете платформи, които най-често се използват за анализ на микробна общност, са 454 FLX и Illumina. Инструментът 454 FLX генерира

1 милион четения на инструмент, с дължина на четене 250–400 bp, а платформата Illumina произвежда до 1,5 милиарда четения на цикъл, с дължина на четене 50–150 bp. По-краткото отчитане на Illumina може да намали филогенетичната разделителна способност, както по отношение на избирането на оперативни таксономични единици (OTU), така и определяне на филогенетични разстояния между OTU. Броят на базовите двойки на четене за платформата Illumina може да се удвои чрез подхода на сдвоени краища (PE), където всяка молекула е секвенирана както от 5 ’, така и от 3’ края [19,20]. Областите на 16s rRNA ген, V1-V2 и V4, са по-дълги от 200 bp, което не може лесно да бъде покрито от PE припокриването. Въпреки това, регионите V3 [13] и V6 [21,22] могат лесно да бъдат покрити от припокриващите се PE четения.

Една от пречките при изучаването на куцотата на BCO при бройлерите е ниската честота, което затруднява систематичното и надеждно изследване на BCO куцотата. Наскоро Wideman et al. разработи модел на телена настилка, при който бройлери, отглеждани върху телена настилка, надеждно предизвикват висока честота на BCO последователно, без целенасочено излагане на птиците на патогенни бактерии [4]. Нестабилната основа, създадена от телена настилка, ускорява образуването на остеохондротични микро фрактури и цепнатини в проксималните епифизарно-физални плочи за растеж на фемората и пищялите. Телените настилки (или липсата на достъп до отпадъци) също предизвикват физиологичен стрес, който може да доведе до имуносупресия и засилена бактериална транслокация от стомашно-чревния тракт в системното кръвообращение [3–5,23].

В това проучване използвахме метода за секвениране сдвоени краища Illumina, насочен към хиперпроменлива област V6 на гена 16S rRNA във връзка с модел на настилка от тел на BCO куцота за цялостно изследване на бактериалните съобщества, свързани с BCO.

Материали и методи

Експеримент с животни и събиране на проби

Птиците във всички камери бяха „разхождани“ и наблюдавани за куцота на всеки два дни, започвайки на 15-ия ден. Птиците, които развиха клинична куцота, бяха хуманно евтаназирани и некропсирани. Наблюденията при изваждане на мъртви и куци птици бяха записани по ден/дата, пол и номер на писалката. На 56-ия ден всички оцелели птици бяха евтаназирани, претеглени и извадени. По време на този експеримент са събрани общо 1372 костни проби от 343 бройлери (4 проби на птица: дясна и лява бедрена кост и пищяли). От този масивен резервоар за проби бяха внимателно подбрани за анализ 97 отделни проби, представляващи всичките 6 диагностични категории [нормална проксимална глава на бедрената кост (нормална бедрена кост); проксимално отделяне на главата на бедрената кост или епифизеолиза (FHS); проксимална некроза на главата на бедрената кост (FHN); нормална проксимална глава на пищяла (Normal Tibia); некроза на тибиалната глава (THN); некроза на главата на пищяла тежка или казеозна (THNsc)], всички 7 възрасти, и двата вида настилки (постеля срещу тел), и двете генетични линии, и двете части на тялото (дясно срещу ляво) (таблица S1).

Макроскопска класификация на лезиите

Бедрената кост и пищялите са категоризирани по макроскопски вид според следните диагностични категории: Нормална бедрена кост; FHS; FHN; Нормална пищяла; THN; THNsc. Във всички експерименти проксималните лезии на бедрената глава бяха категоризирани поотделно (FHS или FHN), а двете нива на некроза на тибиалната глава бяха категоризирани отделно (THN или THNsc), за да се подчертае прогресивната тежест на BCO лезиите [4], както е представено на фиг. 1.