Резюме

В настоящото проучване ние докладваме мутационен анализ на гена POMC във френска кохорта от 322 деца със затлъстяване и 363 контроли. Ние също описваме нова хетерозиготна мутация в αMSH домейна на гена POMC, свързана с ранно настъпващо затлъстяване и с вредни инвитро функционални ефекти.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Директно POMC секвениране на гени.

Това проучване беше одобрено от местната комисия по етика и беше получено информирано съгласие от всички участващи субекти. Геномната ДНК на всички субекти беше изолирана от 10 ml венозна пълноценна кръв (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega Madison, WI). Директното секвениране (Sequencer Applied Biosystem) на кодиращия регион на гена POMC е извършено при 322 несвързани деца със затлъстяване и при 363 деца без затлъстяване. Деца със затлъстяване [средна възраст, 12,8 y ± 2,8 стандартни отклонения (SD); среден индекс на телесна маса (ИТМ) Z. резултат = 4,3 ± 1,2 SD; ИТМ Z. диапазон от 2,0–10,2 SD] са наети в бъдеще между 2001 и 2004 г. в три различни отдела за детско хранене, разположени в Париж, Кан и Маргенция, Франция [както е описано в Dubern и др. (20)]. В настоящото проучване затлъстяването се определя като ИТМ Z. вкара най-малко 2 SD над средните възрастови и специфични за пола стойности на ИТМ при деца във Франция (21). Контролната група включваше 363 неносебни деца (средна възраст, 11,5 y ± 0,6 SD; среден ИТМ Z. оценка = 0,2 ± 1,0 SD; ИТМ Z. резултат, −2,96 до 1,93 SD). Тези деца бяха част от рандомизирано, контролирано текущо теренно проучване (ICAPS) в юноши от първо ниво на средно училище от осем произволно избрани училища в департамента на Бас Рейн (Източна Франция) (22).

Генотипирането на Phe144eu POMC мутацията в семейството на пробанда също се извършва чрез директно секвениране (Sequencer Applied Biosystem) на кодиращите региони на гена POMC. Грундове и условия могат да бъдат предоставени при поискване. Нуклеотидите и аминокиселините бяха номерирани съответно на номера за присъединяване на GenBank V01510 и NP 000930, съответно.

Клинични и биохимични данни.

Всички пациенти със затлъстяване бяха подложени на физически преглед с антропометрични измервания и оценка на етапа на Танер от един и същ изследовател във всеки център. Кривите на височина и тегло са получени от медицинските здравни досиета на субектите.

Активиране на човешки MC4R (hMC4R) от αMSH продукта на Phe144leu POMC.

Leu144αMSH (Leu в позиция 7 на αMSH) и Phe144αMSH (Phe в позиция 7) се синтезират и пречистват чрез високоефективна течна хроматография (Genemed Synthesis Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния). Активността на MC4R беше измерена чрез анализ на способността му да активира експресията на цикличен аденозин монофосфат (сАМР) -индуцируем луциферазен ген в HEK 293 (23). HEK 293 клетки, стабилно експресиращи сАМР-индуцируем луциферазен ген, бяха временно трансфектирани с hMC4R и стимулирани в продължение на 6 часа само със среда, като се увеличиха количествата Phe144αMSH или Leu144αMSH, след което активността на луциферазата беше измерена, както е описано по-горе (23). Точките данни представляват средства за пет определяния, а лентите за грешки показват SD.

Анализ на конкурентно свързване.

HEK 293 клетки, стабилно трансфектирани с hMC4R, бяха инкубирани с [125 I] NDP αMSH в присъствието на нарастващи концентрации на Phe144αMSH или Leu144αMSH. Резултатите се изразяват като процент от общото специфично свързване (Bmax). Кривата е оборудвана с помощта на нелинеен регресионен анализ и модел на конкуренция на едно място (GraphPad Prism, графичен софтуер, Сан Диего, Калифорния). Всяка точка е средната стойност на трикратни стойности. Лентите за грешки показват SD.

РЕЗУЛТАТИ

Честота на POMC мутации при затлъстели и слаби френски деца и идентификация на пациент, носещ Phe144Leu POMC мутация.

Чрез скрининг на 322 деца с тежко затлъстяване за мутации на POMC са идентифицирани девет мутации (Asp53Gly, Gly96Cys, Pro132Ala, Arg236Gly, Glu214Gly, Ala195Thr, Leu209Pro, Phe87Leu, Phe144Leu) при 12 несвързани лица (3.72%, 95% CI]: 3.72%, 95% CI] . Сред тях шест не са докладвани преди това (Asp53Gly, Phe87Leu, Gly96Cys, Pro132Ala, Phe144Leu, Leu209Pro). В контролната група бяха открити уникално две нови мутации (Asn91Ser, Glu57Lys), докато бяха открити две мутации (Glu214Gly, Ala195Thr) както при затлъстели, така и при контролни популации (Таблица 1 и Фигура 1). Четирима пациенти със затлъстяване и една слаба контрола са носители на мутацията Asp53Gly (1,24%). Като цяло честотата на вариациите на POMC гена не се различава значително между затлъстелите (3.72%, 95% CI: 1.66–5.80) и контролите [2.20%, 95% CI: 0.69–3.71, стр = не е значително (NS)] в тази група френски деца. Клиничните и биологичните характеристики на носителите на мутация на POMC (затлъстели и контролни) са показани в Таблица 2. Няма разлика в теглото и ИТМ Z. се наблюдава резултат между носители на генетичен вариант POMC и съответно неносещи в групите със затлъстяване и постно (данните не са показани).

мутационен

POMC протеин и местоположение на вариантите при затлъстели и слаби деца. Бялата и черната кутии са за изрязаните сайтове за персонални компютри. Курсив: мутации, идентифицирани само в контролите. JP, ставен пептид; CLIP, кортикотропин-подобен междинен пептид; LPH, липопротеинов хормон; Ендо, ендорфин.

Тъй като повечето от откритите мутации са настъпили в региони на POMC пропептида с несигурни биологични функции, ние концентрирахме нашето проучване върху новата хетерозиготна мутационна мутация Phe144Leu, разположена в αMSH кодиращата област на POMC гена. Мутацията Phe144Leu е открита само при едно затлъстело дете и липсва в контролната популация. Сегрегационният анализ на мутацията в семейството показа, че мутацията е налице при затлъстелия баща (Фиг. 2A). Другите налични членове на семейството не са носители на мутацията и не са нито с наднормено тегло, нито със затлъстяване.

Родословие, генотип и клинични характеристики на носителя на мутация Phe144Leu POMC. (A) Родословие и генотипове. Пробандът II1 е 12-годишна жена с ИТМ 22,5 kg/m 2 (BMI Z. резултат = 2,7 SD). Тя е хетерозиготна за мутация Phe144Leu (t> c 431). Мутиралият алел е предаден от нейния баща, който е с умерено затлъстяване (ИТМ, 31 kg/m 2 на възраст 38 години, BMI Z. резултат = 1,9 SD). Субекти I2 (ИТМ, 21 kg/m 2 на възраст 40 години, BMI Z. резултат = -0,5 SD), II2 (възраст, 8 г; ИТМ Z. резултат = 0,2 SD) и II3 (възраст, 6 години; ИТМ Z. резултат = 0,9 SD) са неносещи носители на два нормални алела. Затлъстели лица (плътни кръгове и квадрати). Възраст, ИТМ Z. резултат и генотип (+, нормален; -, мутирал) са посочени в родословието; ND, не е определено. (Б.) BMI криви на пробанда (HetPOMC), шест хетерозиготни носители на мутации MC4R (HetMC4R) и три хомозиготни мутанта на нулевия лептинов рецептор (LepR 1, 2, 3). HetPOMC (плътни квадрати); LepR 1 (плътни кръгове); LepR 2 (отворени триъгълници); LepR 3 (твърди триъгълници); HetMC4R (отворени диаманти).

Клиничен и биологичен фенотип на носителя на мутация phe144leu.

Ендокринните и метаболитните изследвания в пробандата показват само умерена хиперинсулинемия с плазмено ниво на инсулин 16,9 μUI/ml 120 минути след поглъщане на глюкоза с нормални нива на глюкоза (Таблица 3). Изследванията на хипоталамо-хипофизарно-надбъбречната ос бяха нормални (свободен кортизол в урината, динамичен тест на оста на надбъбречната жлеза), както и изследванията на оста на щитовидната жлеза (свободен T4 и TSH) (Таблица 3). Измерването на циркулиращия лептин (лептин 20 ng/mL) е в съгласие с нейната пълнота (лептин/кг мастна маса, 1.1). Липидният метаболизъм е незабележим (общ холестерол, 1,7 g/L; триацилглицерол, 0,9 mM). На 12-годишна възраст скоростта на метаболизма в покой, оценена чрез индиректна калориметрия, е нормална за нейния телесен състав (1260 kcal/24 h, 39 kg маса без мазнини).

Функционален ефект на Phe144leu POMC мутацията.

Оценихме способността на Leu144αMSH (мутирал POMC алел) да активира hMC4R чрез сравняване както на производството на сАМР, така и на свързването към рецептора с това на Phe144αMSH (алел от див тип). В нашия анализ, активирането на hMC4R в отговор на Leu144αMSH беше почти напълно премахнато (EC50 не може да се определи) в сравнение с това с Phe144αMSH (EC50 ± SD = 1.5 ± 0.7 nM) (Фиг. 3A). Този резултат се дължи поне частично на драстично промененото свързване на Leu144αMSH с hMC4R (Фиг. 3Б.).

Нарушено активиране и свързване на MC4R от αMSH продукта на Phe144Leu POMC. Leu144αMSH (Leu в позиция 7 на αMSH, съответстваща на мутиралия алел POMC) и Phe144αMSH (Phe в позиция 7, съответстваща на див тип) бяха синтезирани и пречистени с високоефективна течна хроматография. (A) MC4R активност в отговор на Phe144αMSH или Leu144αMSH. Точките данни представляват средства за пет определяния, а лентите за грешки показват SD. EC50 ± SD за активиране на αMSH е 1,5 ± 0,7 nM. (Б.) Анализ на конкурентно свързване на Phe144αMSH или Leu144αMSH върху човешкия MC4R. Всяка точка е средната стойност на трикратни стойности, а лентите за грешки показват SD. IC50 за Phe144αMSH в този експеримент е 29,6 ± 7,52 nM. Phe144αMSH (плътни квадрати); Leu144αMSH (твърди триъгълници).

ДИСКУСИЯ

В нашето проучване честотата на вариациите на POMC гена не се различава значително между затлъстелите и контролните деца. За разлика от MC4R мутациите, които са значително по-чести при затлъстели популации (27,28), това предполага, че значението на POMC мутациите в развитието на затлъстяване остава да бъде обсъдено. Въпреки че носителите на POMC мутации са описани в няколко проучвания (4,5,11–13,16–18), ефектът на мутациите върху фенотипа на затлъстяването изглежда променлив и изследването на функционалните последици от POMC мутациите все още е редки, но необходими за демонстриране на тяхната патогенна роля. Досега само няколко POMC мутации могат да се считат за причина за моногенно затлъстяване (4,12,17,18).

В заключение открихме подобна честота на POMC мутации при слаби и затлъстели деца. Само редки вредни мутации, като описания тук Phe144Leu, биха могли да допринесат за затлъстяването с ранно начало (11–13,16–18). В допълнение към предишни проучвания, нашите открития потвърждават по-малко критичната роля на мутациите на гена POMC в сложния детерминизъм на човешкото затлъстяване в сравнение с мутациите MC4R, които участват в 2% -3% от човешкото затлъстяване (27,28). В допълнение, те могат да потвърдят по-критичната роля на βMSH от αMSH в контрола на човешкия енергиен баланс, тъй като мутациите в αMSH изглежда имат само умерен ефект върху фенотипа на затлъстяването в сравнение с ефекта на мутациите на βMSH и подкрепят физиологичната роля на пътят на меланокортина в регулирането на човешкото тегло.