Минджун Би

1 Отдел за интеграция на китайската и западната медицина, свързаната болница Yantai Yuhuangding на университета в Кингдао, Yantai, Китай

2 Спешен център, свързаната болница Yantai Yuhuangding от университета в Кингдао, Yantai, Китай

Мингвей Джанг

3 Асоциирана болница на Shouguang на Медицински колеж Weifang, Weifang, Китай

Дадун Го

4 Институт за очи на Университета по традиционна китайска медицина в Шандонг, Дзинан, Китай

Weikang Bi

5 Катедра по клинична медицина, Медицински колеж на университета Кингдао, Кингдао, Китай

Бин Лю

6 Вторият клиничен медицински колеж, Университет по традиционна китайска медицина в Шандонг, Дзинан, Китай

Йонг Зоу

1 Катедра по интеграция на китайската и западната медицина, свързаната болница Yantai Yuhuangding на университета в Кингдао, Yantai, Китай

Цин Ли

1 Отдел за интеграция на китайската и западната медицина, свързаната болница Yantai Yuhuangding на университета в Кингдао, Yantai, Китай

Резюме

Отравянето с въглероден окис (CO) е един от най-важните здравословни проблеми и може да доведе до невропатологични промени и неврологични последствия. Въпреки това, малко проучвания са разгледали връзката между отравянето с CO и увреждането на кръвно-мозъчната бариера (BBB). В това проучване изследвахме ефектите на N-бутилфталида (NBP) върху експресиите на протеини на zonula occludens-1 (ZO-1), клаудин-5 и аквапорин-4 (AQP-4) в модел на плъхове с отравяне с CO. Резултатите показват, че съдържанието на вода в мозъка очевидно е повишено и стегнатите връзки между ендотелните клетки са нарушени, което води до значителен мозъчен оток и BBB дисфункция при модел на отравяне с CO при плъхове. Междувременно ултраструктурата на ендотелните клетки и перицитите беше сериозно повредена и експресията на ZO-1 и клаудин-5 беше намалена на ранен етап (Ключови думи: аквапорин-4, кръвно-мозъчна бариера, клаудин-5, CO отравяне, N-бутилфталид, Zonula occludens-1

Въведение

бариера

Химичната структура на NBP и основните му метаболити in vivo: (А)N-бутилфталид, (Б) хидроксилиран метаболит на страничната верига на NBP и (° С) окислен метаболит на NBP след отворен цикъл на лактонен пръстен.

Материали и методи

Експериментален модел и групи

Интервенции за лечение

Всички плъхове са били подложени на хипербарна кислородна терапия веднъж дневно в животинска кислородна камера след излагане на СО до обезглавяване. Параметрите се задават както следва: чист кислород за 5 минути, ускорение 20 минути, 0,2 MPa кислород 60 минути и накрая декомпресия 20 минути. Концентрацията на кислород се поддържа между 95 и 99% в кабината за животни по време на хипербарна кислородна терапия. NBP (Номер на партида: 11040311; чистота: 100%; химическа формула: C12H14O2, молекулно тегло: 190.24) беше любезно подкрепена от Shijiazhuang Pharmaceutical, Co., Ltd, Китай. Плъховете в групата с NBP + CO са прилагани перорално NBP в доза 6 mg/100 g чрез сонда със стомашна сонда на 2 h след излагане на CO, съгласно предишните проучвания (Zhao et al., 2013; Li J. et al., 2015), два пъти на ден до жертвоприношение, а тези в групата на СО и групата с НК са получавали една и съща доза чист зехтин като плацебо по едно и също време.

Определяне на съдържанието на вода в мозъка

След описаните по-горе интервенции, съдържанието на вода в мозъка се открива чрез метод на сухо и мокро тегло (Chen et al., 2015). Накратко, четири плъха във всяка група бяха обезглавени в дни 1, 3, 7 и 14 след дълбока анестезия, съответно с 3% пентобарбитал. Впоследствие целите мозъчни тъкани бяха извадени от черепа и първо претеглени (мокро претегляне). Сухото тегло се получава на електронна везна след изсушаване в електрическа фурна при 100 ° С за 24 часа. След това съдържанието на мозъчна вода се изчислява като процент: съдържание на мозъчна вода (%) = [(мокро тегло - сухо тегло)/мокро тегло] × 100%.

Трансмисионна електронна микроскопия (TEM) с Lanthanum Tracer

Lanthanum tracer често се използва за изследване на клетъчна връзка и промяна на пропускливостта на клетъчната мембрана през последните години (Kalachev, 2015; Yazama et al., 2015). В настоящото проучване четири плъха във всяка група бяха интраперитонеално анестезирани в определени моменти от време и след това бяха последователно перфузирани 0,9% натриев хлорид 200 ml за 1 h и 2% лантанов нитрат-диметил арсен 250 ml от лявата камера за 2 h. След скованост на тялото на плъх, целият мозък беше изваден, а мозъчната кора и хипокампусът бяха изолирани съответно с краниотомия. Освен това тъканите бяха нарязани на три сектора с размер около 1 mm и непрекъснато фиксирани повече от 2 часа във фиксатор на лантанов нитрат. След дехидратация в етанол и ацетон и накисване в 1% осмиев тетроксид за 2 h, мозъчните сектори бяха вградени в E-pon 812 и термично полимеризирани при 60 ° C в продължение на 48 h, накрая нарязани на 90 nm специфични ултратънки секции. При двойно оцветяване на наситен уранилацетат и цитратно олово срезовете се поставят върху медни мрежи (200 меша) и се наблюдават под пропускащ електронен микроскоп (TEM; JEM-100CX2, Япония). Пропускливостта на BBB и ултраструктурните промени бяха оценени чрез ексудация на лантанов нитрат.

Имунохистохимичен анализ

За имунохистохимичен анализ бяха подготвени последователни парафинови парчета мозъчни тъкани. ZO-1 (каталожен номер: sc-8146) моноклонални антитела са закупени от Santa Cruz Company. Всички процедури бяха извършени в съответствие с протоколите на производителя. ZO-1 антитялото се разрежда до 1: 200. Клетките с кафява гранулирана мембрана или цитоплазма под светлинен микроскоп (Leica, Германия) се считат за положителна експресия на ZO-1. Слайдовете за отрицателен контрол бяха добавени 0,01 mmol/l фосфатно буфериран разтвор (PBS) вместо моноклонално антитяло. Четири полета, които не се припокриват, бяха случайно наблюдавани в лявото полукълбо и положителните клетки бяха изчислени от четири серийни среза във всеки плъх под светлинен микроскоп. Използвайки система за обработка и анализ на изображения на Leica Qwin, стойността на оптичната плътност (OD) на целевия протеин във всеки изглед беше определена и стандартизирана от отрицателната контрола (Varghese et al., 2014; Tang et al., 2016).

Имунофлуоресцентно оцветяване

AQP-4 (каталожен номер: sc-9887) и клаудин-5 (каталожен номер: sc-17668) моноклонални антитела са закупени от компанията Santa Cruz. Четири последователни парафинови участъка на всеки плъх бяха фиксирани в 4% параформалдехид при 4 ° С за 15 минути, блокирани неспецифични места за свързване за 2 часа и сондирани с първични моноклонални антитела (анти-AQP-4, разреден 1: 200 в PBS, анти-клаудин-5 1: 150) за 2 часа при 37 ° С, флуоресцентни вторични антитела за 1 час при 37 ° С, накрая монтирани с 50% глицерол. Целият процес се провежда в тъмна стая и предметните стъкла се измиват напълно с PBS, както е описано по-рано (Lochhead et al., 2010). Положителните клетки бяха наблюдавани в четири непокриващи се изображения под флуоресцентен микроскоп (Leica, Германия), а стойността на OD във всеки изглед беше определена от системата за обработка и анализ на изображения Leica Qwin.

За да се определи връзката между местоположението между ZO-1 и клаудин-5, ние използвахме двойно имунофлуоресцентно маркиране в настоящото проучване. ZO-1 (SABC-FITC) е определен като първото оцветяващо антитяло, а клаудин-5 (SABC-CY3) е второто според нюанса на оцветяването. С лазерното възбуждане и приемане с различна дължина на вълната, ZO-1 (разредени 1: 150) положителни клетки се появиха жълто-зелена светлина, докато клаудин-5 (разредени 1: 150) положителни клетки показаха червена светлина под 400-кратен флуоресцентен микроскоп. ZO-1 и claudin-5 положителни клетки бяха наблюдавани в един и същ изглед, използвайки различни дължини на вълната на възбуждане и обединеното изображение беше получено от софтуера photoshop7.0.

Анализ на Western Blot

Четири плъха във всяка група бяха дълбоко обезболени и перфузирани в дадени моменти от времето, както е описано по-горе. Мозъчните проби бяха разделени и прехвърлени в поливинилиденфлуоридни мембрани (Millipore, Billerica, МА, САЩ). След блокиране с Tris-буфериран физиологичен разтвор и разтвор на Tween 20 (TBST), съдържащ 10% обезмаслено мляко за 1 h, мембраните се инкубират с първично антитяло (ZO-1 разреждане 1: 550, клаудин-5 разреждане 1: 500) за 30 минути и след това бяха третирани с конюгирано вторично антитяло от хрян пероксидаза (HRP) в продължение на 2 часа при стайна температура. Освен това мембраните след това се измиват с PBS и се разработват в X оптичен филм съгласно инструкциите на производителя. Стойността на абсорбцията (А) на целевия протеин беше оценена чрез система за образно изследване на Bio-Rad 2000 и софтуер Quantity one и нормализирана спрямо стойността на β-актин в същия образец като вътрешна референция. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра.

Статистически анализ

Всички експерименти бяха повторени поне три пъти. Данните бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD) и разликите в параметрите бяха анализирани с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от t-тест с най-малка значима разлика (LSD) със софтуер за статистика SPSS 19.0 (IBM, Armonk, Ню Йорк, САЩ). Всички тестове се считат за статистически значими при P Фигура2 2 , след остро излагане на CO, съдържанието на вода в мозъка на плъхове в групата на CO се увеличава постепенно на 1-ви ден, достига връх на 3-ия ден и след това постепенно намалява. В сравнение с NC група, имаше статистически разлики в едни и същи часови точки (P ∗ В сравнение с NC група, P # в сравнение с CO група в същата времева точка, P Фигура 3 3 ). Междувременно ултраструктурните увреждания на микросъдовете в хипокампуса и кората бяха отслабени след приложението на NBP и само малка част от лантановите частици преминаха през съдовата стена и изтекоха в мозъчния паренхим, главно разположени в TJs сред съдовите ендотелни клетки и дори пристигнаха до базалната мембрана. Тези резултати предполагат, че NBP може да отслаби мозъчния оток, значително да подобри функцията на BBB и ултраструктурната цялост.

Ултраструктурни промени на кръвно-мозъчната бариера при различни групи. Структурата на BBB е относително непокътната в NC група и частиците на лантанов нитрат са затворени в стените на микросъдовете (А1, А2). Структурната цялост на съдовите стени обаче беше сериозно разрушена в групата на CO и частиците на лантанов нитрат бяха проникнали от стените на съдовете в мозъчния паренхим (B1, B2). За разлика от това, ултраструктурното увреждане на микросъдовете не е сериозно в групата, лекувана с NBP, само малка част от лантановите частици преминават през съдовата стена и изтичат в мозъчния паренхим (C1, C2). Стрелки: частици лантанов нитрат; Bm: базална мембрана; Ек: ендотелна клетка; Fp: процес на крака; Еритроцити: червени кръвни клетки (скалата е 1 μm в A1, B1, C1 и 200 nm в A2, B2, C2; n = 4).

Експресионни нива на ZO-1

Експресии на ZO-1 и клаудин-5 в същия изглед, използвайки двойно имунофлуоресцентно маркиране. (А) ZO-1 положителни клетки; (Б) Claudin-5 положителни клетки; (° С) Коекспресия на протеини ZO-1 и клаудин-5 (обединено изображение). Скалата е 30 μm.

За да изясним връзката между нивата на експресия на трите протеина, направихме линеен регресионен анализ. Въз основа на резултатите от имунохистохимичния и имунофлуоресцентния анализ установихме, че нивата на експресия на протеини ZO-1 и клаудин-5 бързо намаляват при плъхове след отравяне с CO. Въпреки това, след като плъховете отново получиха кислород, експресията им постоянно се увеличаваше и нивото на ZO-1 беше значително корелирано с това на клаудин-5 чрез статистически анализ (r = 0.8930, Фигура Фигура 9 9 ). Този резултат също е в съответствие с този на Western blot анализ. За разлика от вариациите на експресията на протеини ZO-1 и клаудин-5, експресията на AQP-4 е само временно повишена след отравяне с CO при плъхове, като постепенно отново спада с кислородна добавка. Този резултат се различава леко във флуктуацията на ZO-1 протеин и може да съществува отрицателна корелация до известна степен (r = -0,5864, Фигура Фигура 10 10 ).

Връзка между експресията на протеини ZO-1 и клаудин-5. Вариацията на нивото на ZO-1 протеин е подобна на тази на клаудин-5 и съществува положителна корелация между двата протеина (r = 0.8930, n = 4).

Връзка между експресията на протеини ZO-1 и AQP-4. Експресията на AQP-4 се различава леко от флуктуацията на ZO-1 протеин и може да съществува отрицателна корелация между двата протеина до известна степен (n = 4, r = -0,5864).

Дискусия

Схематична диаграма на ZO-1, клаудин 5 и AQP-4 в непрекъснат ендотел и молекулярния механизъм след отравяне с CO. Физиологично, стегнатите съединителни комплекси (включително протеини ZO-1, оклудин и клаудин-5) се закрепват в трансмембранните протеини на ендотелните клетки (синя марка). При патологични обстоятелства като оксидативен стрес, свободни радикали, CO отравяне, хипоксия и възпаление, неутрофили и лимфоцити ще предизвикат свръхпроизводството и активирането на MMP, което впоследствие ускорява лизиса на TJ комплексите и разграждането и транслокацията на ZO-1 и клаудин-5 протеини, което води до увреждане на BBB (червена марка).