Резюме

Хипоталамусният пептид меланин-концентриращ хормон (MCH) играе важна роля в енергийната хомеостаза. Животните, които свръхекспресират MCH, развиват хиперфагия, затлъстяване и инсулинова резистентност. В това проучване са генерирани мишки без MCH рецептор-1 (MCHr1 нокаут) и лептин (ob/ob) двойно нулеви мишки (MCHr1 нокаут ob/ob), за да се изследва дали затлъстяването и/или инсулиновата резистентност, свързана с затлъстелият фенотип на ob/ob мишките е отслабен чрез аблация на гена MCHr1. При MCHr1 нокаутиращи ob/ob мишки, оралното натоварване с глюкоза води до по-нисък отговор на кръвната глюкоза и значително по-ниски нива на инсулин в сравнение с ob/ob мишките, въпреки че няма разлики в телесното тегло, приема на храна или енергийните разходи. В допълнение, MCHr1 нокаутиращите ob/ob мишки имат по-висока локомоторна активност и чиста телесна маса, по-ниска телесна мастна маса и променена регулация на телесната температура в сравнение с ob/ob мишки. В заключение, MCHr1 е важен за инсулиновата чувствителност и/или секрецията чрез механизъм, който не зависи от намаленото телесно тегло.

хормонален

  • НЕТ, кафява мастна тъкан
  • CRH, кортикотропин-освобождаващ хормон
  • MCH, меланин-концентриращ хормон
  • MCHr1, MCH рецептор-1
  • MSH, меланоцит-стимулиращ хормон
  • RER, коефициент на дихателен обмен
  • SCD-1, стеароил-КоА десатураза-1
  • UCP-1, разединяване на протеин-1

Добре известно е, че затлъстяването е основен фактор, допринасящ за развитието на инсулинова резистентност и диабет тип 2. Пациентите с диабет често могат да обърнат инсулиновата си резистентност, като намалят телесното си тегло. Механизмът, свързващ затлъстяването и инсулиновата чувствителност, обаче е слабо разбран. Мутациите в гена ob водят до затлъстяване и инсулинова резистентност и това може да служи като модел за повишен прием на храна, водещ до затлъстяване и инсулинова резистентност.

Мишки, носещи дефектен ob ген, развиват затлъстяване и инсулинова резистентност, което прави тези мишки добър модел за индуцирана от хиперфагия инсулинова резистентност. Мишките с дефицит на лептин ob/ob са със затлъстяване, хиперфагия, хиперинсулинемия, резистентност към инсулин и имат намалена телесна температура и енергийни разходи (рев. За 15). Лептинът се секретира главно от адипоцитите и функционира за потискане на апетита, увеличаване на енергийните разходи и повишаване на основната температура при мишки (15), както и на симпатиковата активност в кафявата мастна тъкан (НДНТ) (16). Освен това лептинът повишава нивата на глюкоза, инсулин и глюкагон чрез механизми, изискващи непокътнати симпатикови нерви (17). За разлика от това, MCH може да намали симпатиковата активност, тъй като нокаутиращите мишки MCHr1 имат повишен симпатиков тонус (11) и инфузията с MCH намалява телесната температура при мишки (6). Тези открития предполагат, че MCH и лептин имат противоположни ефекти върху автономната нервна система.

Целта на това проучване беше да се изследва ролята на MCHr1 във фенотипа на лептинодефицитни мишки със затлъстяване. Инсулиновата чувствителност и глюкозният клирънс са изследвани чрез извършване на орален тест за глюкозен толеранс. Също така изследвахме телесното тегло, телесните мазнини, приема на храна и енергийните разходи, както и серумната химия и натрупването на мазнини в черния дроб. Нещо повече, телесната температура и нивата на експресия на несвързания протеин-1 (UCP-1) в НДНТ са измерени като индикация за ефекти върху автономната нервна система.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

MCHr1 нокаутиращи мишки са генерирани в AstraZeneca Transgenics and Comparative Genomics, както се съобщава по-рано (11) и се пресичат седем поколения до C57BL/6. Мишките ob/+ бяха доставени от Harlan Olac (Blackthorn, Bicester, UK), напълно обратно кръстосани в C57BL/6. Мишките бяха настанени на групово хранене и хранени със стандартна диета, съдържаща 4% общо липиди, 18,5% протеини, 55,7% въглехидрати и 3,5% фибри (R36; Лактамин, Стокхолм, Швеция) в съответствие с добра практика при животните. След 4-седмична възраст мишките бяха настанени единично. Генотипизирането се извършва чрез PCR. За гена MCHr, един праймер е разположен нагоре по течението в късото рамо (5′-GAGTCCCCAGCATTGAGAAC-3 ′), втори праймер, разположен в екзоновата част (5′-AGCTCCCACTGACATCACCT-3 ′), и третият, разположен в PGK- NEO промотор (5′-AGCGCATGCTCCAGACTGCCTT-3 ′). Мутацията на ob се открива с помощта на комбиниран PCR и рестрикционен разграждащ подход, използвайки факта, че ob мутацията създава ново място на рестрикционен ензим. PCR фрагментите се амплифицират, като се използват праймерите (5′-GACTTCATTCCTGGGCTTCA-3 ′) и (5′-ATCCAGGCTCTCTGGCTTCT-3 ′), а получените продукти се усвояват с DdeI (In Vitro Швеция, Стокхолм, Швеция). Изследването е проведено в съответствие с етичния сертификат, одобрен от местната етична комисия за експерименти с животни.

Генериране на MCHr1 нокаутиращи ob/ob мишки.

В първата стъпка от размножаването, MCHr1 нокаутиращи (-/-) мишки бяха кръстосани на ob/+ мишки, за да генерират потомство, което беше хетерозиготно както за MCHr1 (+/−), така и за мутацията ob (ob/+). След това тези съединени хетерозиготни мишки бяха кръстосани и бяха идентифицирани нокаут MCHr1 (-/-) ob/+, както и MCHr1 див тип (+/+) ob/+. И накрая, MCHr1 нокаут (-/-) ob/+ бяха кръстосани, за да се получи мъжки MCHr1 нокаут ob/ob и MCHr1 нокаут ob див тип (+/+) за изследването. Също така, MCHr1 див тип ob/+ бяха кръстосани, за да се получат мъжки MCHr1 див тип ob/ob и MCHr1 див тип ob мишки от див тип (+/+), които бяха изследвани.

Растеж на тялото, прием на храна и фекални анализи.

Теглото на тялото се измерва седмично между 4 и 23 седмична възраст. За да се измери приемът на храна, клетките (23 × 16 cm) се приготвят с нормална диета и се сушат при 80 ° C за 1 h, за да се коригират евентуалните разлики във влажността. След 12 часа при стайна температура клетките бяха претеглени точно. Мишките на 20-седмична възраст са гладували в продължение на 12 часа, през тъмния период, преди да бъдат поставени в предварително претеглените клетки със свободен достъп до храна и вода. Мишките бяха оставени в клетката за 48 часа и след това бяха върнати в оригиналните си клетки. Всички екскременти бяха събрани за по-нататъшен анализ. Клетките бяха повторно инкубирани 1 h при 80 ° C, за да изсъхнат разливите от вода и урината и претеглени отново след 12 h. Изпражненията от животните се сушат при 55 ° С през нощта и се съхраняват в херметически затворени контейнери при -20 ° C, докато се анализират. Брутното енергийно съдържание на фекалните пелети се определя с помощта на бомбен калориметър (C 5000; IKA Werke, Staufen, Германия).

Непряка калориметрия, активност и излагане на студ.

Непряката калориметрия беше измерена, както е описано по-рано (18) при 24-седмични мишки при 22 ° C. Взеха се мерки за 5 s на всеки 9 минути. Данните от първите 2 часа бяха изключени от анализа, за да се даде възможност за аклиматизация към новата среда. Локомоторната активност се наблюдава както в калориметричните камери в продължение на 48 часа, така и в кутиите за активност (Kungsbacka mät-och reglerteknik, Kungsbacka, Швеция) в продължение на 1 час, 10: 00–11,00 ч. Ректални температури са регистрирани при 26-седмични съзнателни мишки с помощта на ректална сонда (компоненти, доставени от ELFA, Järfälla, Швеция). Отчитането на температурата беше направено 1 минута преди и в следните моменти от времето, след като мишките бяха поставени в 6 ° C-студено помещение: 15, 30, 45 и 60 минути.

Количествено определяне на телесните мазнини и чистата телесна маса.

Телесните мазнини (%) и чистата телесна маса (g) се определят чрез денситометрия при 25-седмични мишки, както е описано по-рано (19).

Тест за толерантност към глюкоза.

Мишки на възраст от 28 седмици са гладували 12 часа (от 12:00 до 12:00 ч.) Преди перорално приложение на глюкозен разтвор (2 g/kg). Кръвта от опашката се събира 1 минута преди и 5, 15, 30 и 60 минути след прилагане на глюкоза. Нивата на глюкоза бяха измерени с помощта на устройство Accu-chek и плазмокалибрирани тест ленти (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Нивата на инсулин се определят чрез използване на свръхчувствителен набор за анализ на имуносорбентен инсулинов ензим (Crystal Chem, Downers Grove, IL). За по-нататъшно изследване на инсулиновата чувствителност беше направено изчисление QUICKI, както следва: 1/[log (I0) + log (G0)], където I0 е инсулинът на гладно (ng/μl), а G0 е глюкозата на гладно (mmol/l) . Преди това е доказано, че QUICKI корелира добре с чувствителността към инсулин при хората (20).

Вземане на проби.

Тъкани и серум са събрани, както е описано по-рано (21). Черният дроб и НДНТ са претеглени преди замразяване. Съдържанието на триглицериди в чернодробните биопсии се определя с помощта на триглицериден CP комплект (ABX Diagnostics, Монпепелие, Франция).

Анализ на серума.

Кортикостеронът беше измерен с помощта на комплект за радиоимуноанализ (Код RPA 548; Amersham Biosciences, Упсала, Швеция). За триглицериди и общ холестерол е използван CHOD-PAP (TG/GB, № 12146029216, холестерол № 2016630; Roche Diagnostics, Манхайм, Германия) и са анализирани нивата на нестерифицирани мастни киселини, като се използва нестерифициран набор за анализ на мастни киселини C (Кат. № 999-75406; Wako Chemicals, Neuss, Германия). Профилите на разпределение на холестерола са измерени, както е описано по-рано (19).

Определяне на експресията на иРНК.

Цялостна екстракция на РНК, синтез на кДНК и количествено определяне бяха извършени, както е описано по-рано (21). Последователностите на праймерите и сондите, използвани в Taqman PCR, са представени в Таблица 1.

Статистика.

Глюкозен толеранс, серумна химия и експресия на кортикотропин-освобождаващ хормон.

Нивата на глюкозата на гладно не се различават значително между групите (фиг. 2А). Интересното е, че инсулинът на гладно е с 49% по-нисък при нокаутиращите ob/ob мишки с MCHr1 в сравнение с ob/ob мишките (съответно 31 ± 8 и 61 ± 9 ng/ml, фиг. 2В). QUICKI изчисленията разкриват, че нокаутиращите ob/ob мишки MCHr1 имат значително по-висок индекс в сравнение с ob/ob (съответно 0,46 ± 0,04 и 0,38 ± 0,01, P 40% по-ниски при нокаутиращите мишки ob/ob в сравнение с ob/ob мишки (Таблица 2). Нивото на експресия на кортикотропин-освобождаващия хормон (CRH) в хипоталамуса не се различава между групите (данните не са показани). Серумните нива на триглицеридите и холестерола, както и разпределението на холестерола в различните класове липопротеини не са различен между нокаутиращите ob/ob мишки MCHr1 и мишките ob/ob (фиг. 2С и таблица 2).

Косвена калориметрия, двигателна активност и телесен състав.

48-часовото индиректно калориметрично измерване не разкрива разлика в съотношението на дихателния обмен (RER) или енергийните разходи между нокаутиращите MCHr1 ob/ob и ob/ob мишките, въпреки че и двете групи се различават от мишки от див тип (Фиг. 3А). Спонтанната двигателна активност се измерва както в продължение на 48 часа в клетките с индиректна калориметрия (фиг. 3С), така и над 1 час през деня в кутии за активност (фиг. 3D). MCHr1 нокаутиращите ob/ob мишки имат по-висока локомоторна активност в сравнение с ob/ob мишките, както през 48-часовия курс (P 60 g. Интересното е, че орален тест за толерантност към глюкоза разкрива, че MCHr1 нокаутният ob/ob има по-ниски нива на глюкоза 15 минута след прилагане на глюкоза, по-нисък инсулинов отговор и по-ниски нива на инсулин на гладно в сравнение с ob/ob мишките QUICKI, който преди това е валидиран като индекс, който корелира добре с инсулиновата чувствителност (20), е по-висок при MCHr1 нокаут ob/ob мишки в сравнение с ob/ob мишките. Тези открития ясно показват повишена инсулинова чувствителност и предполагат, че MCHr1 допринася за лошата инсулинова чувствителност на ob/ob мишките. В допълнение, MCHr1 нокаутиращите ob/ob мишки имат по-висока чиста маса, по-ниска телесна мазнина, по-висока двигателна активност и по-добра толерантност към студ от ob/ob мишките.

Добре известно е, че затлъстяването е основният рисков фактор за инсулинова резистентност и диабет тип 2 (rev. In 3). MCHr1 нокаутиращите ob/ob мишки имат значително по-нисък глюкозен и инсулинов отговор на перорално глюкозно натоварване в сравнение с ob/ob мишки. По-ниските нива на инсулин показват подобрена инсулинова чувствителност, което предполага роля на MCHr1 в регулирането на инсулиновата чувствителност. Това се подкрепя от неотдавнашна публикация, показваща, че централната инжекция с MCH на плъхове предизвиква инсулинова резистентност, без да влияе върху телесното тегло (24). По-високата чиста телесна маса и по-ниските телесни мазнини могат отчасти да обяснят подобрената чувствителност към инсулин. Въпреки това, забележимото намаляване на нивата на инсулин вероятно се дължи и на други физиологични промени, освен на малките промени в телесния състав. Интересно е да се отбележи, че при хората упражненията подобряват глюкозния толеранс. По този начин, повишената локомоторна активност при MCHr1 нокаутиращи ob/ob мишки може също да играе роля в подобрената чувствителност към инсулин.

MCH и MCHr1 също влияят на метаболизма на глюкозата при неносебни животни. MCHr1 нокаутиращите мишки имат по-нисък инсулин на гладно и инсулинов отговор на орално глюкозно предизвикателство в сравнение с мишки от див тип в съответствие с предишни констатации за ниски нива на инсулин при нокаутиращи мишки MCHr1 (9,10). Допълнителен механизъм, чрез който MCH може да повлияе метаболизма на глюкозата, е секрецията на инсулин. MCHr1 иРНК присъства в В-клетките, произвеждащи инсулин, и MCH може да стимулира секрецията на инсулин (25). Предполага се, че MCH, като невротрансмитер, играе важна роля в автономните аспекти на метаболизма, включително контрола на панкреаса (26). MCH присъства и в плазмата на плъхове (14). По този начин, тъй като мишките с нокаут MCHr1 ob/ob имат малко по-бавен глюкозен клирънс, не можем да изключим, че дефицитът на MCHr1 в В-клетките води до намалена секреция на инсулин в мишките с нокаут MCHr1 ob/ob.

Глюкокортикоидите участват в глюкорегулацията чрез намаляване на чернодробната и периферната чувствителност към инсулин (27). Добре известно е, че мишките с дефицит на лептин имат повишени нива на глюкокортикоиди (28,29). За разлика от това, както MCH, така и невропептидът EI могат да стимулират оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза и да повишат нивата на кортикостерон (30). В нашето проучване нокаутиращите ob/ob мишки с MCHr1 имат 40% по-ниско ниво на кортикостерон в сравнение с ob/ob мишките. Въпреки това, нивото на експресия на CRH не се различава статистически между групите, което предполага, че ефектът на MCHr1 е след CRH. По-ниските нива на кортикостерон в нокаутиращите ob/ob мишки с MCHr1 могат да допринесат за по-ниските нива на инсулин и подобрения метаболизъм на глюкозата. По този начин инхибиторните ефекти на лептина върху оста на хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза могат да включват MCHr1 и пътя на MCH, както е подкрепено и от констатации в MCH нокаут ob/ob мишки (31).

Съществуват множество доказателства, според които MCH и MCHr1 влияят върху телесното тегло, приема на храна и енергийния баланс, както и върху действието на лептин и инсулин (4-11,14,25). Орексигенните пептиди невропептид Y и MCH са регулирани в ob/ob мишките, което може да бъде обяснение за наблюдаваната хиперфагия (32,33). MCHr1 нокаутиращите ob/ob мишки, използвани в това проучване, бяха също хиперфагични като ob/ob мишките. Следователно, приносът на тези сигнали към хиперфагията на ob/ob мишки изглежда не изисква функционален MCHr1. Освен това, MCHr1 не се изисква като медиатор за друг орексигенен пептид: грелин (21).

MCHr1 нокаутиращите ob/ob мишки са имали повишена локомоторна активност в сравнение с техните ob/ob котила, което може да допринесе за по-високата чиста маса и по-ниската телесна мазнина. Добре установено е, че допаминът и допаминовите рецептори променят локомоторната активност (rev. В 34). Наскоро беше показано, че нокаутиращите мишки MCHr1 имат регулирани мезолимбични допаминови рецептори и норепинефринови транспортери, което показва, че MCHr1 може да модулира мезолимбичните моноаминови функции (35). Тези открития могат частично да обяснят повишената двигателна активност.

Високият RER показва, че нокаутиращите MCHr1 ob/ob и ob/ob мишките използват предимно въглехидрати като източник на енергия, докато мазнините се съхраняват. Чернодробното съдържание на мазнини беше високо и в двете групи затлъстяване. SCD-1 участва в биосинтеза на мононенаситени мазнини и е силно регулиран при ob/ob мишки (22). Нивото на SCD-1 иРНК не се различава между нокаутиращите MCHr1 ob/ob и ob/ob мишките. Това наблюдение се различава от констатациите при нокаутиращите ob/ob мишки с MCH, които са намалили експресията на SCD-1 в сравнение с ob/ob мишките, въпреки високото съдържание на чернодробни триглицериди (31). По този начин, MCH и MCHr1 могат да се различават в регулацията на гена SCD-1.

Мишките с дефицит на лептин MCH и нокаут MCHr1 също се различават по отношение на растежа на тялото, чистата маса, нивата на инсулин и енергийните разходи. Базалната основна телесна температура не се различава между MCHr1 нокаут ob/ob и ob/ob, за разлика от констатациите при MCH нокаут ob/ob мишки (31). Както е показано за MCH нокаут ob/ob мишки, MCHr1 нокаут ob/ob има подобрена термогенеза в отговор на излагане на студ, но намаляването на телесната температура е по-слабо изразено при MCHr1 нокаут ob/ob мишки (това проучване и 31). Разликите между моделите показват, че MCH има и други начини за сигнализиране, освен чрез MCHr1. Генът MCH също кодира други невропептиди, невропептид EI, невропептид GE и MCH ген, отпечатан полипептид (2,36). Друго възможно обяснение е, че другите невропептиди, получени след протеолитична обработка от прехормона MCH, влияят на тези параметри чрез отделни сигнални пътища. Дали невропептид GE съществува като функционално активен пептид не е ясно, но е доказано, че невропептидът EI се експресира с MCH и променя локомоторната активност (37,38), докато MCH генът с надпечатан полипептид влияе върху секрецията на соматостатин (36).

Това проучване характеризира нокаута на MCHr1 на фона на дефицит на лептин и нашите открития ясно показват, че липсата на MCHr1 влияе върху нивата на инсулин, двигателната активност, телесната температура, телесните мазнини и чистата телесна маса. Не са установени статистически значими разлики в приема на храна, телесното тегло, енергийните разходи, чернодробните триглицериди или серумните липиди в сравнение с ob/ob мишките. Нашите данни показват, че нокаутиращите ob/ob мишки с MCHr1 са подобрили чувствителността към инсулин, въпреки че са силно затлъстели. MCHr1 може също да е важен за автономния контрол на телесната температура, действащ чрез симпатиковата нервна система. Когато MCHr1 нокаут ob/ob беше сравнен с преди това докладвания MCH нокаут ob/ob, имаше няколко разлики, включително телесно тегло, чиста телесна маса и разход на енергия. Причината за тези разлики може да се дължи на други известни пептиди от гена MCH или че MCH упражнява своите действия чрез множество сигнални системи в допълнение към MCHr1.