Сатору Арата

център за биотехнологии, Университет Шоуа, Токио, Япония

b Център за лабораторни животински науки, Университет Шоуа, Токио, Япония

Джун Ватанабе

център за биотехнологии, Университет Шоуа, Токио, Япония

Масако Маеда

c Колеж за изкуство и наука във Fujiyoshida, Университет Showa, Токио, Япония

Масато Ямамото

c Колеж за изкуство и наука във Fujiyoshida, Университет Showa, Токио, Япония

Хидето Мацухаши

b Център за лабораторни животински науки, Университет Шоуа, Токио, Япония

Мамико Мочизуки

b Център за лабораторни животински науки, Университет Шоуа, Токио, Япония

Нобуюки Кагами

b Център за лабораторни животински науки, Университет Шоуа, Токио, Япония

Казухо Хонда

d Катедра по анатомия, Медицински факултет, Университет Showa, Токио, Япония

Масахиро Инагаки

c Колеж за изкуство и наука във Fujiyoshida, Университет Showa, Токио, Япония

Резюме

Ракът е водеща причина за заболеваемост и смъртност в световен мащаб; следователно ефективните мерки за профилактика и лечение на рака са в постоянно търсене. Екстрактите от Inonotus obliquus (гъба Chaga) демонстрират мощни антитуморни дейности и са били използвани за лечение на рак в няколко страни; все пак действителният ефект и основните механизми все още не са ясни. В настоящото проучване имахме за цел да изследваме ефектите от непрекъснатия прием на воден екстракт от I. obliquus върху туморната супресия.

Основни методи

Противораковата активност на екстракта от I. obliquus беше изследвана на миши модели на растеж на белодробен карцином на Луис и спонтанни метастази след 3 седмици непрекъснат прием на екстракт в доза от 6 mg/kg/ден, което съответства на тази, приета ежедневно с инфузия на Chaga в Япония.

Основни констатации

Екстрактът от I. obliquus причинява значителни туморни супресивни ефекти и при двата модела. По този начин при мишки, носещи тумор, се наблюдава 60% намаляване на тумора, докато при метастатичните мишки броят на възлите намалява с 25% в сравнение с контролната група. Освен това, мишките, третирани с екстракт от I. obliquus, демонстрират увеличаване на агломерацията на тумора и инхибиране на васкуларизацията. Интересното е, че приемът на I. obliquus намалява телесното тегло при мишки на средна възраст и повишава телесната температура в отговор на превключването светло-тъмно при зрели възрастни мишки. Освен това, I. obliquus предотвратява спада на температурата при мишки след имплантиране на тумор.

Значимост

Нашите открития показват, че екстрактът от I. obliquus може да се използва като естествено средство за потискане на рака чрез насърчаване на енергийния метаболизъм.

1. Въведение

В това проучване изследвахме противоракови ефекти от непрекъснатия прием на екстракт от I. obliquus, използвайки миши модели на туморогенеза и спонтанни метастази. Дозата на екстракт от I. obliquus (6 mg/kg/ден) се изчислява въз основа на дневния прием на екстракта като запарка от чай в Япония. Също така тествахме телесната температура в реално време с помощта на имплантиран нано-термометър. Това е първото проучване, което показва, че непрекъснатият прием на воден екстракт от I. obliquus потиска прогресията на рака и поддържа телесната температура.

2. Материал и методи

2.1. Животни

C57BL/6 мишки, получени от Japan SLC Inc. (Shizuoka, Япония) на възраст от 8 седмици, бяха държани в стаята с контролирана температура (23 ± 2 ° C) и 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светва в 8 съм). Всички експериментални процедури, включващи животни, са одобрени от институционалния комитет за грижи и употреба на животните на университета Showa (номер на разрешение: 55019), който работи в съответствие с японското правителство за грижи и използване на лабораторни животни.

2.2. Приготвяне на воден екстракт от I. obliquus

I. obliquus склероции са събрани от брези в град Фуджиошида, префектура Яманаши, Япония и идентифицирани от д-р. Машаси Осава и Хисаси Шибата от Института за изследвания на горите Яманаши, Япония. Материалът се праши и 32,0 g се суспендират в 1 L вода, кипват се 90 минути, за да се концентрират до 200-300 ml. Екстрактът се филтрува през филтърна хартия (№ 101, Advantec, Токио, Япония) и се суши лиофилно, като се получават 1,3 g (4,1% суровина). Той се разтваря повторно в стерилизирана дестилирана вода до концентрацията от 2,4 mg/ml и се съхранява при -80 ° C като основен разтвор.

2.3. Култура на ракови клетки

Клетъчната линия на белодробния карцином на Lewis (3LL) е получена от Националния институт по биомедицински иновации (Осака, Япония) и се поддържа в среда RPMI 1640, допълнена с глутамин (2 mM), пеницилин (100 U/ml), стрептомицин (100 μ g/ml) ) и 10% (v/v) топлинно инактивиран FBS (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA).

2.4. I. obliquus противоракова активност при миши модели на карцином и спонтанни метастази

2.5. Хистохимия

Тъканите бяха потопени в 20% захароза в 0,1 М фосфатен буфер (рН 7,2) при 4 ° С и вградени в O.C.T. съединение (Sakura Finetek, Токио, Япония). Замразените срезове се нарязват с микротом с дебелина 8 μm, промиват се в PBS (рН 7.2) и се оцветяват с хематоксилин и еозин на Гил (HE). За имунооцветяване тъканните срези бяха третирани с 0,3% H2O2 в PBS, за да се потуши ендогенната пероксидазна активност, блокирани в 5% нормален конски серум в PBS в продължение на 60 минути и инкубирани през нощта с плъх анти-CD31 поликлонални антитела (1: 500; 550274, BD Biosciences, East Rutherford, NJ, USA) при 4 ° C. Секциите се измиват с PBS и се инкубират с биотинилиран кози анти-плъх IgG (1: 200; BA-4001, Vector, Burlingame, CA, USA) в продължение на 2 часа при стайна температура, последвано от реакция с комплексен разтвор на авидин-биотин (Vector ) и хромоген диаминобензидин (вектор). Изображенията са заснети с помощта на микроскоп AX70 (Olympus, Токио, Япония).

2.6. Измерване на телесната температура

Телесната температура на мишката се проследява с помощта на DST нано-Т температурен регистратор (17 mm × 6 mm, 1 g; STAR ODDI, Gardabaer, Исландия). Дровосеците са имплантирани в корема и телесната температура непрекъснато се измерва на интервали от 30 минути.

2.7. Статистически анализ

Извършен е несдвоен T-тест, за да се оцени значимостта на независимите експерименти след отстраняване на статистически отклонения с помощта на теста за отхвърляне на Smirnoff-Grubbs. Три групи (фиг. 5 В и С) бяха сравнени, използвайки еднопосочен ANOVA с тест за множество сравнения на Tukey. За статистически анализ е използван софтуерът Ekuseru-Toukei (Social Survey Research Information Co. Ltd., Токио, Япония). P стойности Фиг. 1 А); няма разлика в приема на вода между двете групи (фиг. 1 Б). Интересното е, че екстрактът от I. obliquus не причинява промени в телесното тегло или количеството консумирана вода при зрели възрастни мишки (фиг. 1 С и D). Тези данни предполагат, че приемът на екстракт от I. obliquus насърчава липолизата в развитата мастна тъкан; следователно при по-нататъшни експерименти използвахме зрели възрастни мишки (12–15 седмици), за да избегнем влиянието на разликата в телесното тегло между контролните и лекуваните мишки, наблюдавани преди имплантацията на тумор, върху последващия туморен растеж.

непрекъснатият

Екстрактът от I. obliquus причинява туморна агломерация и потиска васкуларизацията. 3LL клетки се инжектират подкожно в лявата част на корема на мишки, питейна вода със или без воден разтвор на I. obliquus и туморите се анализират чрез хистология 7 дни след имплантирането на клетки. (А) ОН оцветяване. (B) Имунооцветяване за CD31.

3.4. Непрекъснатият прием на екстракт от I. obliquus потиска метастазите

За по-нататъшно изследване на антитуморните ефекти на екстракта от I. obliquus той беше тестван в модел на спонтанна метастаза в белодробната тъкан, предизвикана чрез интравенозно инжектиране на 3LL клетки. Първо, анализирахме белодробни метастази под стереомикроскоп 14 дни след имплантиране на тумор. Както е показано на фиг. 4 А и В, белодробните възли при мишки, третирани с I. obliquus, са склонни да намаляват в сравнение с контролната група. След това белите дробове от животни, анестезирани на ден 9 след инокулация на ракови клетки, бяха анализирани за броя на белодробните възли с помощта на микро-КТ. Резултатите показват, че приемът на екстракт от I. obliquus значително намалява броя на туморните възли в белите дробове (фиг. 4 С и D). Хистологичният анализ (оцветяване с НЕ) на туморни възли показа, че приемът на I. obliquus намалява размера и предизвиква агломерирана морфология на туморните възли (фиг. 5). Тези данни предполагат, че непрекъснатият прием на екстракт от I. obliquus може да потисне прогресията на тумора.

Непрекъснатият прием на екстракт от I. obliquus предотвратява намаляването на телесната температура при мишки, имплантирани белодробни карциномни клетки на Lewis. (А) Средна телесна температура на мишки, измерена от 2 до 3 седмица след приема на питейна вода без или с воден екстракт от I. obliquus. (B, C) Средна телесна температура на мишки, получаващи вода (B) или екстракт от I. obliquus (C), измерена 1 седмица преди (0 седмица) и 1 седмица и 2 седмици след инжектиране на ракови клетки. Данните са изразени като средна стойност (n = 3 за група); * P Фиг. 1 А), но не и при зрели възрастни мишки (Фиг. 1 В), което предполага, че приемът на I. obliquus насърчава липолизата в натрупаната с възрастта мастна тъкан. Предишно проучване показа, че водоразтворимите компоненти, извлечени от I. obliquus, подобряват чувствителността към инсулин и намаляват затлъстяването при затлъстели мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини [17], което предполага благоприятни антихипергликемични ефекти и подобряване на липидния метаболизъм. В съответствие с нашия резултат, това проучване не открива разлика в телесното тегло между контролата и мишките, третирани с екстракт от I. obliquus, хранени с нормална диета. С оглед на връзката, разкрита между затлъстяването и множество видове рак [3], непрекъснатият прием на воден екстракт от I. obliquus може да има потенциал за потискане на тумора чрез насърчаване на липидния метаболизъм.

5. Заключение

Показахме, че непрекъснатият прием на екстракт от I. obliquus може потенциално да потисне развитието на рак чрез поддържане на телесната температура. Освен това мишки на средна възраст, пиещи екстракт от I. obliquus, показват загуба на телесно тегло. Нашите открития предполагат, че водният екстракт от I. obliquus може да се използва като естествен продукт за потискане на рака и общо здравеопазване.

Декларации

Изявление за принос на автора

Сатору Арата: Замисля и проектира експериментите; Извършва експериментите; Анализира и интерпретира данните; Написа хартията.

Джун Ватанабе: Изпълнява експериментите; Написа хартията.

Масако Маеда, Масато Ямамото: Реактиви, материали, инструменти за анализ или данни.

Хидето Мацухаши, Мамико Мочизуки, Нобуюки Кагами: Изпълнява експериментите.

Kazuho Honda: Замисля и проектира експериментите.

Масахиро Инагаки: Замисля и проектира експериментите; Реактиви, материали, инструменти за анализ или данни, допринесени.

Извлечение за финансиране

Това изследване не е получило конкретна субсидия от финансиращи агенции в публичния, търговския или нестопанския сектор.

Конкурираща декларация за лихва

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Допълнителна информация

Няма налична допълнителна информация за този документ.