Втората свързана болница на Харбинския медицински университет,

патогенезата

Катедра по обща хирургия Харбин, 150000 (Китай)

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Пиенето на алкохолни напитки е обща черта на социалните събирания, а етанолът е основната съставка във всички видове алкохолни напитки. Консумацията на етанол е свързана с приблизително 60 различни вида заболявания [1-4]. Добре известно е, че злоупотребата с алкохол може да причини остър ерозивен хеморагичен гастрит, а продължителното пиене може да причини стомашни разстройства и хроничен атрофичен гастрит [5-7]. По принцип гастритът се дължи главно на дисбаланса между агресивни и защитни фактори на стомашната лигавица, което причинява различни проблеми, от локални дефекти до активно възпаление [8-11]. Все повече се признава, че този вид хронично възпаление има значителен потенциал за насърчаване на тумора [12, 13]. Точното регулиране на прогресията на възпалението е от решаващо значение за хроничните възпалителни разстройства и за потискане на деправацията на патогенетичните състояния. Съвременните терапевтични агенти на гастрит обикновено се използват за инхибиране на секрецията на стомашна киселина и за стимулиране на защитните механизми на лигавицата [14-18]. Тези стратегии обаче обикновено се провалят поради свръхчувствителност, гинекомастия, импотентност, аритмия и промени в кръвообразуването [19-21]. Следователно изследването на механизмите на гастрит и намирането на нови терапевтични средства са жизненоважни.

Материали и методи

Клетъчна култура и лечение

GES-1 клетки са получени от ATCC. Клетките се отглеждат в RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA), съдържащ 10% фетален говежди серум (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Израел) и се инкубират при 37 ° C във влажен въздух с 5% CO2. След засяване в 96-ямкова плака, клетките се третират с етанол в концентрации 0, 0,5%, 1%, 2%, 4%, 8% и 16%. Използва се MTT анализ за определяне на жизнеспособността на клетките. За да се изследват ефектите на етанол и инхибитор на каспаза-1 (100 μM), клетките се третират или с етанол, или с етанол, така и с инхибитора на каспаза-1.

MTT анализ

За да се измери клетъчната жизнеспособност, 1 х 104 клетки на гнездо се посяват в 96-гнездова плака и се третират, както е описано по-горе. След третиране към всяка ямка се добавят 10 μl МТТ реагенти (0,5 mg/ml) и се инкубират в продължение на 4 часа при 37 ° С. Гранулаторите на формазин в ямките се разтварят със 150 μl диметилсулфоксид (DMSO) и абсорбцията при 570 nm се измерва с помощта на четец за микроплаки.

Тунел оцветяване

Увреждане на ДНК е установено чрез оцветяване чрез терминална дезоксинуклеотидил трансфераза dUTP nick-end маркиране (TUNEL) с помощта на комплект за откриване на апоптотични клетки, следвайки указанията на производителя (Promega, Madison, WI, USA).

ОН оцветяване

За наблюдение на хистологичните промени се използва оцветяване с хематоксилин и еозин (HE). Стомашни тъкани от мишки или тъкани от рак на стомаха и съседни нормални тъкани от хора бяха фиксирани в 4% параформалдехид и вградени в парафин. Пробите бяха нарязани на участъци с дебелина 5 μm и оцветени с НЕ.

Имунофлуоресцентно оцветяване

За оцветяване с имунофлуоресценция, култивираните клетки се фиксират с 4% буфериран параформалдехид. След това клетките се измиват в PBS и се инкубират с блокиращ разтвор (1% BSA и 0,1% Triton-X в PBS). Впоследствие клетките се инкубират с първични антитела срещу каспаза-1 в продължение на една нощ при 4 ° С, последвано от инкубация с вторичното антитяло (Invitrogen) за 1 h при стайна температура. Ядрата се оцветяват с помощта на 4 ’, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; Beyotime, Шанхай, Китай) в продължение на 20 минути при стайна температура. Изображенията са заснети с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Имунохистохимично оцветяване

За имунохистохимичен анализ, замразени проби от стомашно сечение бяха фиксирани с 4% буфериран параформалдехид и вградени в парафин. Образците се дехидратират с възходяща серия етанол и се изчистват с ксилол. Всички срезове бяха имунооцветени с първични антитела срещу каспаза-1, IL-1β и IL-18 при 4 ° С за една нощ. След инкубация с вторични антитела срезовете бяха оцветени с диаминобензидин.

Имунособентен анализ, свързан с ензимите

Културната среда се събира за измерване на IL-1β и IL-18, като се използва ELISA комплект (uscn-SEA064R и uscn-SEA563Ra) съгласно инструкциите на производителя [35].

Миши модел на алкохолен гастрит

Мъжки мишки Kungming (25-30 g) са получени от Центъра за експериментални животни на Медицинския университет в Харбин. Тези мишки бяха разделени на три групи с по пет мишки във всяка група. В контролната и етаноловата групи мишките бяха третирани отделно чрез солен разтвор или 2% етанол (20 ml/kg/d). В групата на инхибитора на каспаза-1 и етанола мишките получават 2% етанол или 2% етанол с инхибитор на каспаза-1 (20 mg/kg/d) интраперитонеално. На 15 дни след лечението мишките бяха упоени и евтаназирани чрез цервикална дислокация. Стомасите бяха събрани и изплакнати с физиологичен разтвор и използвани за следното откриване. Всички експериментални протоколи са предварително одобрени от Експерименталната комисия по етика на животните към Медицинския университет в Харбин, Китай. Използването на животните е потвърдено с Ръководство за грижа и употреба на лабораторни животни, публикувано от Националния здравен институт на САЩ (NIH Publication No. 85-23, ревизиран 1996 г.).

qRT-PCR

Общите РНК от клетки или тъкани бяха извлечени с помощта на реактив Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Екстрахираната РНК се транскрибира обратно в двуверижна cDNA с комплект за обратна транскрипция (Toyobo, Osaka, Japan). Впоследствие се използва SYBR Green PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems, Калифорния, САЩ) за количествено определяне на нивото на експресия на иРНК на каспаза-1 и IL-1β. PCR в реално време се извършва със системата за PCR в реално време 7500 FAST (Applied Biosystems, CA, USA), като се използва GAPDH като контрола. Правата и обратната последователност на праймера за каспаза-1 са съответно 5’-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3 ’и 5’-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3’. За IL-1β предният праймер беше 5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3 ’, а обратният праймер беше 5’-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA-3’. За IL-18 праймерът беше 5’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3 ’, а обратният грунд беше 5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’.

Western blot анализ

Общият протеин се екстрахира от клетките с помощта на RIPA буфер (Thermo, Шанхай, Китай), съдържащ фенилметансулфонилфлуорид (PMSF) (Beyotime, Китай). Общите протеинови концентрации се измерват с тест за Брадфорд и комплект за анализ на протеини (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Тридесет μg от протеиновия лизат се подлагат на електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и се прехвърлят върху PVDF мембрани (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). PVDF мембраните бяха блокирани с 5% BSA в 0,05% Tween 20-TBS за 1 час и инкубирани със съответното първично антитяло. След това смесите се разреждат в блокиращ буфер една нощ при 4 ° С. Разрежданията за първични антитела бяха както следва: анти-каспаза-1 (1: 1 000, Cell Signaling, 2225), анти-IL-1β и анти-IL-18 (1: 400, Santa Cruz Biotech). След обширно измиване с TBST се добавя анти-заешко IgG-HRP вторично антитяло (1: 5 000, Santa Cruz Biotech). Протеиновите ленти бяха визуализирани с помощта на усъвършенстваната техника на хемилуминесценция с хемилуминесцентен субстрат SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific, САЩ).

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуера SPSS 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Проведена е еднопосочна ANOVA за нормално разпределени данни. Всички данни са изразени като средна стойност ± SD. Статистическата значимост беше определена на P