Резюме

Предишни проучвания са идентифицирали тРНК три изоформи, кодиращи интерлевкин-15 (IL-15), които се получават чрез диференциално сплайсинг и кодират за същия зрял IL-15 протеин с два различни сигнални пептида. Нашият анализ на чревни епителни клетки на мишки разкри две нови IL-15 mRNA изоформи, генерирани от различни алтернативни събития на сплайсинг. В една форма (IL-15ΔE6) екзон 6 отсъства, а във втората форма първите 48 nt от екзон 7 отсъстват (IL-15ΔE7) чрез използване на алтернативно 5 'място на сплайсинг в екзон 7. Тези иРНК изоформи, кодирани вътрешнорамни IL-15 протеинови варианти, на които липсва или 15aa (IL-15ΔE6), или 16aa (IL-15ΔE7), като и двата използват нормалния дълъг сигнален пептид. За тези нови изоформи на IL-15 бяха предвидени значителни структурни промени. Анализите за защита на РНКаза разкриват най-високата експресия на изоформната иРНК в чревния епител и функционалният анализ на рекомбинантни IL-15 изоформни протеини предполага възможни регулаторни функции.

Въведение

Интерлевкин 15 (IL-15) е 14-15 kDa гликопротеин от 114aa и принадлежи към 4-теα-семейство цитокини от спирален пакет (включително IL-2, -4, -6, -7, -9, -15 и -21). IL-15 работи чрез рецептор, състоящ се от високоафинитетен IL-15 рецептор α-верига, IL-2/15 рецепторът β-верига и общото γ-верига (γ° С). 1,2 IL-15 споделя някои биологични функции с IL-2 по отношение на инвитро стимулиране на активиране и пролиферация на Т-клетки, индукция на цитолитична активност на NK-клетките и производство на имуноглобулин от В клетки. 3, 4, 5, 6 Последни проучвания установяват основната роля на IL-15 в развитието, хомеостатичната пролиферация и активирането на NK клетки, NKT клетки и чревни IEL. 7, 8, 9, 10, 11, 12 IL-15, заедно с IL-7, също е от съществено значение за хомеостатичната регулация на CD8 Т-клетките с памет. 13, 14, 15, 16, 17, 18 Най-малко в случай на пролиферация на Т-клетъчна памет и преживяемост на NK-клетките в паметта на CD8, IL-15 работи чрез необичаен механизъм, наречен транспрезентация, при който IL-15Rα-верига, експресирана от един клетъчен тип, представя свързан IL-15 към клетки, експресиращи IL-15Rβ и γC. 7, 16, 19, 20, 21 По-нататъшни проучвания разкриват IL-15 като плейотропен цитокин с по-широки биологични функции извън регулацията на имунната система, като медииране на анаболни ефекти върху скелетните мускули. 22, 23

Като мощен имуномодулатор с широки биологични функции, експресията на IL-15 е строго контролирана на нивото на транскрипция, транслация и вътреклетъчен трафик. 24 Алтернативното сплайсинг е общ регулаторен механизъм, използван за генериране на варианти на много биологично и имунологично важни молекули като TCR ζ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, CD44 и CD45, и също се отнася за IL-15. 25 В случаите на IL-2, IL-4 и IL-6 сплайсинг варианти, на които липсва екзон, се смята, че са естествени инхибитори на цитокиновата сигнализация, действащи по същество като доминиращи отрицателни форми на цитокина, които се конкурират с цитокина с пълна дължина за рецепторно свързване. 26, 27, 28 За IL-15, идентифицираните досега варианти на сплайсиране на иРНК кодират един и същ зрял протеин с пълна дължина, но с два различни сигнални пептида. Алтернативното сплайсинг води до генериране на три IL-15 иРНК изоформи, получени чрез следните комбинации за използване на екзон: Екзони 1-2-3-4-5-6-7-8; Екзони 1-3-4-5-6-7-8 или Екзони 1-3-4-Φ (алтернативен екзон 5) -5-6-7-8). Изоформите IL-15 използват или къси сигнален пептид (специфичен за последователността (SSP), 21aa при човек, 26aa при мишка) или необичайно дълъг сигнален пептид от 48aa (LSP). 29

Въпреки че се смята, че експресията на IL-15 е строго контролирана, остава неясно дали съществува специфична за тъканите експресия и регулиране на IL-15 изоформите. Предишни изследвания показаха, че и двете IL-15 иРНК изоформи с SSP и LSP последователности се експресират в активирани моноцити/макрофаги, няколко клетъчни линии, тестиси, сърце, тимус и апендикс, докато само LSP-IL-15 изоформа mRNA се експресира в скелетните мускули и бъбреците. 30, 31, 32 Сега идентифицирахме две нови изоформи на IL-15 иРНК, присъстващи в чревния епител на мишка, на едната липсва екзон 6, а на другата липсва част от екзон 7. И двете кодират протеини в рамката с помощта на LSP и изглежда инхибират IL-15 с пълна дължина в медиирането на пролиферацията.

Резултати

Молекулярно клониране на нови IL-15 изоформи

Генът на мишка IL-15 се състои от 7 интрона и 8 екзона, 33 докато част от интрон 4 е идентифициран по-късно като алтернативен екзон 5. 34 Две IL-15 mRNA изоформи с различни последователности, кодиращи сигнален пептид (48aa LSP и 26aa SSP) присъстват в различни миши тъкани. 30, 31, 32, 35 Тъй като е известно, че IL-15 се експресира в чревния епител 36, 37, 38, ние искахме да определим дали тъканно специфична експресия на IL-15 изоформи съществува в червата на мишката. За тази цел извършихме PCR с обратна транскрипция за IL-15 от РНК на чревни епителни клетки на мишки. Два продукта от 619 и 483 bp са предвидени за изоформите, свързани с използването на LSP и SSP, съответно. Получени са обаче три cDNA продукти в диапазона 400–650 bp (Фигура 1а). Продуктите се клонират в ТА вектор и се избират рекомбинантни плазмиди, които съдържат един от всеки от трите продукта, както е показано чрез рестрикционно ензимно разграждане (Фигура 1b).

новите

След това изолираните PCR продукти бяха подложени на ДНК секвениране, което потвърди, че средният по размер продукт представлява нормална IL-15 кДНК и че най-големият продукт съответства на IL-15 изоформата, използвайки алтернативен екзон 5, което води до добавяне на 136nt. Последователността на cDNA, получена от множество плазмиди, разкри, че най-малкият PCR продукт всъщност съдържа две последователности, които са или с 45, или с 48 nt по-къси от нормалната последователност на IL-15 cDNA (Фигура 1в). Подравняванията на последователностите бяха използвани за сравняване на тези последователности с IL-15 кДНК. Нито една последователност не съдържа алтернативния екзон 5 (Фигура 1в). В една изоформа екзон 6 (45 nt) отсъстваше с останалата част от последователността, идентична на нормалния IL-15, ние нарекохме тази изоформа IL-15ΔE6 (номер за присъединяване към GenBank DQ083236); в другата изоформа първите 48 nt от екзон 7 отсъстваха чрез използване на алтернативно 5 'място на сплайсинг 5'CAG ∣ GU3′ В рамките на екзон 7 и поради това ние нарекохме този вариант IL-15ΔE7 (номер за присъединяване към GenBank DQ083237). По този начин двете изоформи на cDNA се различават по дължина само с 3 nt, което обяснява невъзможността за разделяне на продуктите чрез стандартна гел електрофореза.

Прогнозирана протеинова последователност и вторична структура на изоформи IL-15ΔE6 и IL-15ΔE7

Според включването или изключването на екзон 2 и алтернативен екзон 5, предишни проучвания са идентифицирали три алтернативно сплайсирани IL-15 иРНК изоформи (Фигура 1г, получени от Нишимура и др. 29). Въпреки използването на различни сигнални пептидни кодиращи последователности, известните изоформи кодират за същия зрял протеин. В новите изоформи, описани тук, отсъствието на екзон 6 в IL-15ΔE6 или част от екзон 7 в IL-15ΔE7 би довело до производство на различни пресечени зрели протеини (Фигура 1d). Това беше разкрито в изведените протеинови последователности на IL-15ΔE6 и IL-15ΔE7, които кодират протеини в рамката. Изтриването на екзон 6 би довело до загуба на 15aa (18 SIHIDTTLYTDSDFH 32), а съкращаването на екзон 7 би довело до 16aa делеция (33 PSCKVTAMNCFLLELQ 48) (Фигура 2а). В допълнение, докато протеинът IL-15ΔE6 ще запази местата на вътреверижната дисулфидна връзка, присъстващи в зрял IL-15, промените в последователността в IL-15ΔE7 биха довели до загуба на два цистеина, участващи в дисулфидното свързване (Фигура 2b).

Анализ на протеинови последователности и вторични структури, предсказвани за нови IL-15 изоформи. (а) Подравняване на изведени аминокиселинни последователности в зрелия протеин на IL-15 изоформите. (б) Схематична илюстрация на IL-15 изоформни протеини. Излюпената площ от 15аа в нормален IL-15 е кодирана от екзон 6 и отсъства от изоформа ÄE6; празна област, кодирана от частичен екзон 7, съдържа Cys20 и Cys27, които представляват две дисулфидни връзки в нормален IL-15. Липсата на 16aa от изоформа ÄE7 води до прогнозираната загуба на дисулфидните връзки. Кутиите не се изтеглят в мащаб. (° С) Вторична структура на IL-15 изоформните протеини, генерирани от програмата SOPMA. The α спиралите са показани като върхове (a – d). Аминокиселинните числа в зрелия протеин са посочени на х брадви.

Тъй като IL-15 е член на 4-теα-helix bundle цитокиново семейство, ние също анализирахме вторичната структура на новите IL-15 изоформи (Фигура 2в). Формата IL-15ΔE6 съдържаше всичките 4α спирали (A – D), въпреки че по-къс свързващ цикъл между спиралите A и B е резултат от отсъствието на 15aa, кодиран от екзон 6. Интересното е, че подобна структура с по-къс цикъл между първите 2 α спирали присъства в антагонистичните алтернативно снадени изоформи на IL-2 и IL-4. 26, 39 Като се има предвид сходството на структурата и биологичните функции между IL-15 и IL-2, възможно е IL-15ΔE6 да бъде антагонист на нормалния IL-15. В случая на IL-15ΔE7 бяха предвидени драматични промени във вторичната структура със загубата на втория α спирала (Фигура 2в). IL-15Rα местата на свързване за миши IL-15 все още не са идентифицирани, но второто и третото α спирали на човешки IL-15 са места за взаимодействие на човешки IL-15Rα. 40 Ако това важи за миши IL-15, IL-15ΔE7 може да има променена свързваща активност за IL-15Rα или IL-15Rβγ-вериги.

Разпределение на тъкани и относително изобилие на IL-15 изоформи

Разпределение на тъкани и относително изобилие на IL-15 иРНК изоформи. (а) Анализ за защита на RNase с 32 P-маркирана антисенс сонда, предназначена да открие и трите изоформи. Външните платна съдържат сонди за IL-15, Bcl-2, L32 и GAPDH, като стандарти за размер на РНК. Нарязаните стрелки показват фрагменти на РНК сонда, защитени от храносмилането на RNase чрез тъканна иРНК. Домакинските гени L32 и GAPDH се използват като вътрешен контрол. Показаните резултати са представителни за три експеримента. (б) Количествено определяне на IL-15 иРНК изоформи от тъкани. Резултатите са показани като средно и стандартно отклонение на интензитета на изображението от три експеримента, след като се нормализира до съдържанието на иРНК в домакинския ген GAPDH във всяка тъкан и се стандартизира до това на нивата на GAPDH РНК в бъбреците.

Експресия и функционален анализ на IL-15ΔE6 и IL-15ΔE7

Експресия на протеин и функция на IL-15 изоформи. (а) Western Blot от пречистени IL-15 изоформни протеини с анти-IL-15 поликлонално антитяло. Протеините се експресират като негови маркирани слети протеини от Е. коли. и се пречиства през Ni-NTA агарозна колона. (б) Анализът CTLL-2 се извършва в три екземпляра с 1: 2 серийни разреждания на нормално пречистена колона, ΔE6 и ΔE7 изоформи. Подобни количества от всяка изоформа бяха добавени към анализа, както беше определено чрез Western blot анализ с анти-Xpress mAb (данните не са показани). Протеинът LacZ е използван като отрицателна контрола за биологичния тест CTLL-2. (° С-д) Рекомбинантен човешки IL-15 се добавя при 80 ng/ml към клетките CTLL-2 в присъствието на титрувани дози от нормално IL-15 с маркирани като положителна контрола (° С), изоформа ΔE7 (д), или изоформа ΔE6 (д). Данните са показани като средно и стандартно отклонение на трикратни анализи на ямки.

Дискусия

Материали и методи

Мишките C57BL/6J са закупени от лабораторията Jackson, Bar Harbor, ME, САЩ.

Изолиране на чревни епителни клетки

Чревни епителни клетки от мишки C57BL/6J бяха изолирани по нискотемпературен метод, както беше описано по-рано 52 с малки модификации. Накратко, две тънки черва бяха отстранени и промити със студения балансиран солев разтвор на Ханк/0,5 m M DTT, изведнъж върху пипета на Пастьор, нарязани на парчета 2-3 mm, разбърквани при 4 ° C в продължение на 5 минути и гранулирани чрез центрофугиране. След това чревните парчета се инкубират в 150 ml хелатен буфер с pH 7,3 (27 m M тринатриев цитрат, 5 m M Na2HPO4, 96 m M KH2PO4, 1,5 m M KCL, 0,5 m M дитиотреитол, 55 m MD-сорбитол, 44 m M захароза) при 4 ° C при непрекъснато разбъркване в продължение на 20 минути и след това се промива в 20 ml студен хелатиращ буфер в 50 ml конична епруветка с леко разклащане. Фрагментите се измиват със студен хелатиращ буфер 10 пъти и супернатантата се събира (флюсови частици). Утайката отново се разбърква в 100 ml свеж хелатиращ буфер при 4 ° С в продължение на 10 минути, промива се 10 пъти и супернатантата се събира (фракция на криптата). Морфологията на вилусните клетки и криптните клетки се потвърждава чрез микроскопия.

Молекулярно клониране на IL-15 изоформи

Анализ за защита на RNase

Прясно изолирани тъкани и органи от мишки C57BL/6J бяха бързо замразени и смачкани, разтворени и хомогенизирани в GIT буфер (5 М гуанидин изотиоцианат, 50 m M Tris-HCl рН 7,5, 10 m М EDTA рН 8,0 и 5% 2-меркаптоетанол), наслоен над 5,7 М CsCl, след това се върти при 55 000 об/мин за 3 часа. Качеството и целостта на РНК се определят чрез спектрофотометър и анализ на агарозен гел.

Експресия и пречистване на протеини

Рекомбинантните pET100/D-TOPO плазмиди, съдържащи зрели кодиращи протеин последователности на нормален IL-15 (N), или IL-15ΔE6, или IL-15ΔE7 и положителен контрол pET100/D-TOPO-LacZ (Invitrogen) бяха трансформирани в BL21 Star ™ (DE3) Единични клетки (Invitrogen), единични колонии бяха взети и култивирани в LB среда. н′ Терминална 6 × експресия на протеини с His-маркер се индуцира чрез добавяне на 1 m М IPTG в продължение на 4-5 часа и бактериите се събират чрез центрофугиране при 6000 rppm. за 10 минути. Протеините се пречистват чрез афинитетна хроматография чрез Ni-NTA агароза (Qiagen 30210) съгласно продуктовия протокол.

Уестърн блотинг

Пречистените протеини се разделят на 10–20% градиент SDS-PAGE (BioRad, Hercules, СА) гел и се прехвърлят върху PVDF мембрана (BioRad) при постоянен ток от 100 mA. Мембраната PVDF беше инкубирана с миши анти-Xpress Ab (Invitrogen 46-0528), миши анти-HisG Ab (Invitrogen 46-1008) или заешки анти-миши IL-15 поликлонални Ab (eBiosciences, Сан Диего, Калифорния, САЩ), последвани от чрез вторичен Abs заешки анти-миши IgG (Sigma, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) или кози-анти-заешки IgG (KPL 214-1516), конюгиран с HRP и разработен от усъвършенстван ECL комплект за откриване (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, САЩ).

CTLL-2 анализ

CTLL-2 клетки се поддържат в хранителна среда (модифицирана среда на Dulbecco Eagle, снабдена с 10% фетален телешки серум, 0,1 m M. Минимално необходима среда, несъществени аминокиселини, 2 m M L -глутамин, 5,5 × 10 -5 M β-меркаптоетанол, 1 m М натриев пируват, 10 m M HEPEs pH 7,4, 50 mg/ml гентимицин сулфат и 100 μ/ ml пеницилин/100 μg/ml стрептомицин) с добавяне на рекомбинантен човешки IL-2 (получен чрез програмата за реагенти NCI BRB). За анализа CTLL-2 клетките в растеж на логаритна фаза се промиват три пъти в среда без IL-2. Подобни концентрации (както е определено чрез анти-Xpress mAb Western blot, данните не са показани) на пречистен нормален IL-15, IL-15ΔE6, IL-15ΔE7 или контролен рекомбинантен протеин LacZ бяха серийно разредени в 100 μ1 RPMI в 96-ямкови плаки, последвано от добавяне на 4000 CTLL-2 клетки/100 μл/добре. За теста за блокиране, 20 μ1 стандартна rhIL-15 80 ng/ml се добавя в ямките, съдържащи разредени His-N, His-IL-15ΔE6 или His-IL-15ΔE7 преди добавянето на CTLL-2 клетки. Клетките се инкубират в продължение на 18 часа при 37 ° С. 1 μCi/гнездо [3Н] тимидин се добавя към културата за последните 6 часа. Клетките се събират и включването на [3Н] тимидин се измерва с течен сцинтилационен брояч.