• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Мей Динг
  • За кореспонденция: lyguan @ genetics.ac.cnmding @ genetics.ac.cn

Резюме

ER стресът се появява при много физиологични и патологични състояния. Обаче как хроничният ER стрес се облекчава в специфични клетки в непокътнат организъм е изключителен въпрос. Тук свръхекспресирането на протеина UNC-9 (некоординиран) на междинната връзка в невроните на C. elegans задейства медиираната от Ire1-Xbp1 реакция на стрес в зависимост от възрастта и автономно от клетките. P38 MAPK PMK-3 действа върху фосфорилирането на IRE-1 за регулиране на хроничния стрес. Свръхекспресиращият междинно протеин също активира автофагията и инсулиновият път функционира чрез автофагия, но не и транскрипцията на гени, кодиращи ER шаперони, за да противодейства на медиираната от p38-Ire1-Xbp1 реакция на стрес. Заедно тези резултати разкриват сложна клетъчна регулаторна мрежа в отговор на хроничен стрес в подмножество клетки в многоклетъчния организъм.

стрес

Резюме на автора Натрупването на разгънати протеини задейства ER реакцията на стрес (UPR), което позволява на клетките да се борят срещу колебанията в експресията на протеини както при физиологични, така и при патологични условия. Тежките реакции на остър ER стрес могат да бъдат предизвикани от медикаментозно лечение. Въпреки това, такъв интензивен ER стрес рядко се среща повсеместно при всеки тип клетки in vivo. Тук ние проектирахме генетична система в нематода C. elegans, която ни позволява да индуцираме ER стрес в специфични клетки, без медикаментозно лечение или други външни стимули, и след това да наблюдаваме стресовата реакция. Използвайки тази система, генетични екрани установиха, че p38 MAPK директно действа чрез клона IRE-1-XBP-1 на UPR за насърчаване на реакцията на стрес. Междувременно инсулиновият рецептор функционира чрез активиране на автофагия, за да противодейства на пътя p38-IRE-1-XBP-1. Заедно тези резултати разкриват сложна клетъчна регулаторна мрежа в отговор на хроничен стрес в многоклетъчния организъм.

Въведение

Протеините, предназначени за секреция или вмъкване в мембраните, навлизат в ендоплазматичния ретикулум (ER) в разгъната форма и обикновено напускат само след като достигнат родните си състояния. По време на нормалната функция секреторна клетка може да изпита драматични промени в потока от нови протеини чрез нейната ER в отговор на промените в търсенето. Нарушаването на баланса между секреторния протеинов синтез и капацитета на сгъване на ER активира сигнална мрежа, наречена Unfolded Protein Response (UPR) в опит да поддържа хомеостазата [1]. UPR намалява транслацията на протеини, увеличава експресията на ER шаперони и ензими, за да улесни сгъването на протеини и изчиства неправилно сгънатите протеини за разграждане [1]. Обширната или продължителна активност на UPR сигнализира, че натрупването на неправилно сгънати протеини е преодоляло компенсаторните механизми на UPR и може да се предизвика апоптотичен отговор [2]. За разлика от тях, някои видове рак използват защитната роля на UPR, за да поддържат своя бърз растеж [3, 4]. Следователно, UPR може да служи или като апоптотичен изпълнител, или като цитопротектор, в зависимост от клетъчния контекст.

Макроавтофагията (наричана по-долу автофагия) е процес на клетъчна деградация, иницииран в отговор на стрес. Той се опитва да възстанови метаболитната хомеостаза чрез лизозомно разграждане на цитоплазмени органели или цитозолни компоненти [14]. Автофагията изисква основен набор от консервирани протеини, известни като свързани с автофагия протеини (Atg) и се медиира от органела, наречена автофагозома [15]. Автофагозомните мембрани произхождат от ER, комплекса на Голджи, митохондриите, ендозомите и плазмената мембрана [16, 17]. По време на формирането и разширяването на структурата на автофагозомния предшественик, наречена фагофор, се улавят и затварят цитозолен материал и повредени субклетъчни органели. След това пълната затворена автофагозома се слива с лизозомите, за да се превърне в автолизозома, вътре в която настъпва разграждане и рециклиране на нейното съдържание. Автофагията се активира при условия на стрес на ER и много от компонентите, които медиират автофагията, са идентифицирани като UPR целеви гени и са важни за клетките да оцелеят при тежък ER стрес [18, 19].

Резултати

Превишението на UNC-9: GFP в DD/VD невроните задейства реакцията на ER на стрес

При C. elegans двигателните неврони от тип D, включително 6 DD и 13 VD, са набор от GABAergic неврони с клетъчни тела, разпределени по вентралната нервна връв и невронални процеси, издаващи се както по вентралната, така и върху гръбната връв [25]. ]. unc-25 кодира GABA биосинтетичния ензим глутаминова киселина декарбоксилаза [26]. Използвахме промотора Punc-25, за да свръхекспресираме GFP (зеления флуоресцентен протеин) кондензиран протеин UNC-9 на DD-VD неврони. Ектопично експресираният UNC-9: GFP се разпределя с точкообразен модел по протежение на невроналните процеси и вътре в клетъчната област на тялото на DD/VD невроните (Фиг. 1А и 1В). За разлика от това, UNC-9: GFP knock-in (KI) линия, създадена с помощта на техниката CRISPR-Cas9, показва точкообразен модел върху невроналните процеси и клетъчната повърхност, но не и в областта на клетъчното тяло на DD/VD (Фигура 1C ). Двойното оцветяване с маркери, обозначаващи различни субклетъчни отделения, демонстрира много малко припокриване между извънматочната UNC-9: GFP puncta и ER маркера CYTB-5.1: mCherry или маркера на Golgi mCherry: MANS (Фиг. 1В). Вместо това голяма част от сигнала UNC-9: GFP се разпределя върху плазмената мембрана (ко-локализирана с Myr: mCherry), ранните ендозоми (ко-локализирани с mCherry: RAB-5) и късните ендозоми или лизозоми (съвместно локализиран с mCherry: RAB-7) (фиг. 1В).

(A) UNC-9: GFP (зелен), задвижван от промотора Punc-25, се изразява в DD/VD неврони. Отделните DD/VD клетъчни тела са обозначени със * и са оградени с пунктирани линии. Скалата представлява 10 µm. (B) Клетъчната локализация на UNC-9: GFP (зелено) в DD/VD клетъчни телесни области. ER, Golgi, плазмена мембрана, ранни ендозоми и късни ендозоми/лизозоми са обозначени с CYTB-5: mCherry (червено), mCherry: MANS (червено), Myr: mCherry (червено), mCherry: RAB-5 (червено) и mCherry: RAB-7 (червено) съответно. Отделните DD/VD клетъчни тела са обозначени със * и са оградени с пунктирани линии. (C) UNC-9: GFP, експресиран на ендогенно ниво чрез нокаут (KI), се разпределя върху невронните процеси и клетъчната повърхност на DD/VD невроните (звездички). Скалите в (B) и (C) представляват 5 µm. (D) Нивото на експресия на Phsp-4: mCherry (червено) е увеличено при DD/VD. Белите стрелки показват DD/VD комисиони. Звездичките показват DD/VD клетъчни тела. „-“ маркира изчистващите клетки (целомоцити), които са непоследователно подчертани от Phsp-4: mCherry. Скалата представлява 25 µm. (E) Phsp-4: mCherry (червен) сигнал се индуцира в Punc-25: UNC-9: GFP (зелено) експресиращи клетки. Скалата представлява 5 µm.

За да тестваме дали свръхекспресията на UNC-9 в DD/VDs задейства реакцията на ER на стрес, ние изследвахме експресията на репортер, съдържащ mCherry, слят с промотора на гена hsp-4. hsp-4 кодира червеевия хомолог на ER шапероновия протеин Bip и неговата транскрипция е силно индуцирана от реакцията на стрес [9]. При липса на извънматочна UNC-9: GFP, Phsp-4: mCherry е широко, но слабо разпространен в множество тъкани (S1A Фиг.). Когато UNC-9: GFP беше свръхекспресиран в DD/VD неврони, открихме, че mCherry сигналът не е увеличен в други неврони или други тъкани (S1A и S1B Фиг.). Вместо това, Phsp-4: mCherry беше специално индуциран в DD/VD неврони (Фигура 1D и 1E). Има повече от 60 неврони с техните клетъчни тела, разпределени по вентралната връв [25]. Както е показано на Фигура 1D, само комисурите (бели стрелки) и телата на клетките (звездички) на 19 DD/VD неврони (18 ± 0,7, N = 22) (S1B Фигура) могат да бъдат ясно визуализирани от Phsp-4: mCherry сигнал. Анализът на двойното маркиране допълнително потвърди, че mCherry сигналът е съвместно разпределен специално с промотора Punc-25, задвижван от UNC-9: GFP експресиращи клетки (S1B Фиг. И Фиг. 1E).

UPR клонът IRE1-XBP1 регулира субклетъчната локализация на свръхекспресирания UNC-9: GFP в невроните

(A) Разпределението на UNC-9: GFP (зелено), задвижвано от промотора Punc-25 в различни UPR мутанти. (Б) Количествено определяне на UNC-9: Дефект на локализация на GFP при различни мутирали животни с UPR. N = 20 за всеки генотип; *** P Клетъчнозащитната роля на клона IRE-1-XBP-1 UPR при условия на стрес. (А) Прогресивният UNC-9: GFP (зелен) локализационен дефект при ire-1 (v33) животни в сравнение с див тип. Скалите представляват 5 µm. Пунктирани линии обграждат DD/VD клетъчните тела. Отделни DD/VD клетъчни тела са заобиколени от пунктирани линии. Звездичките показват нормални клетки. Белите стрелки сочат към дефектни клетки. (B) Количествено определяне на броя DD/VD клетки в различни генотипове. N е посочен за всеки генотип.

(А) Прогресивният UNC-9: GFP (зелен) локализационен дефект при ire-1 (v33) животни в сравнение с див тип. Мащабните ленти представляват 5 µm. Пунктирани линии обграждат DD/VD клетъчните тела. Отделни DD/VD клетъчни тела са заобиколени от пунктирани линии. Звездичките показват нормални клетки. Белите стрелки сочат към дефектни клетки. (Б) Количествено определяне на броя на DD/VD клетки в различни генотипове. N е посочен за всеки генотип.

След това изследвахме дали продължителният отказ на UPR в DD/VD невроните води до клетъчна смърт. С маркера Punc-25: mCherry, около 17 DD/VD неврони могат да бъдат еднозначно идентифицирани при животни от див тип (Фигура 3B). Подобен брой DD/VD се наблюдава, когато е налице излишък UNC-9: GFP (фиг. 3В), което предполага, че функционалната UPR система е в състояние да поддържа клетките живи при ER стресови условия. За разлика от това, когато ire-1 или xbp-1 бяха премахнати, общият брой DD/VDs спадна значително (Фигура 3B). За отбелязване е, че намаленият брой клетки се появява само при условия на стрес. Нито ire-1, нито xbp-1 мутацията причиняват невронална загуба при липса на излишък UNC-9: GFP (Фигура 3В). Въвеждането на копие от див тип на гена ire-1 или xbp-1 в DD/VD значително спасява невроналната загуба съответно при мутирали животни ire-1 или xbp-1 (Фигура 3В). Следователно, медиираната от IRE1-XBP1 реакция на стрес има благоприятен ефект при продължителен хроничен стрес in vivo.

pmk-3 е необходим за реакцията на стрес на ER

(А) Намаляването на експресията на Phsp-4: mCherry (червено) при ire-1 или xbp-1 мутанти не се спасява от daf-2. (B) Частичното намаляване на експресията на Phsp-4: mCherry (червено) в pmk-3 мутанти не се потиска от daf-2. Звездичките показват DD/VD клетъчни тела. Скалите в (A) и (B) представляват 25 µm. (C) Разпределението на mCherry: LGG-1 (червено) при отсъствие или присъствие на UNC-9: GFP в DD/VD неврони. Скалата представлява 5 µm. (D) Количествено определяне на броя на mCherry: LGG-1 puncta в DD/VD клетъчни телесни области. N е посочен за всеки генотип. (E) UNC-9: GFP (зелена) точка, частично се локализира с mCherry: LGG-1 (червена). Скалата представлява 5 µm. Звездичките показват DD/VD клетъчни тела. (F) Количествено определяне на броя на mCherry: LGG-1 puncta в DD/VD клетъчни телесни области в различни генотипове. N е посочен за всеки генотип. (G) Лечението с глад частично потиска мутантния фенотип ire-1. Различните модели на разпределение на UNC-9: GFP (зелено) в областта на тялото на DD/VD клетки са обозначени с цветните кутии. N е посочен за всеки генотип. (З) UNC-9: GFP разпространение при диви и lgg-1 мутантни животни. Скалата представлява 25 µm.

Автофагията е катаболен механизъм, който доставя неправилно сгънати протеини и увредени органели за разграждане. След това попитахме дали автофагията участва в потискането на daf-2. Първо изследвахме дали свръхекспресията на UNC-9: GFP индуцира автофагия при DD/VD. Използвайки маркиран с mCherry LGG-1 (ортолог на C. elegans на дрожден автофагичен протеин Atg8), задвижван от промотора unc-25, изследвахме активността на автофагията в DD/VD невроните. При липса на UNC-9: GFP, mCherry: LGG-1 се разпространява дифузно по невронните процеси и обикновено има по-малко от 4 mCherry: LGG-1 puncta в областта на клетъчното тяло (Фигура 7C и 7D). Когато UNC-9: GFP беше свръхекспресиран, броят на mCherry: LGG-1 пункта драстично се увеличи както в областта на клетъчното тяло (повече от 10 пункта), така и в невроналните процеси на DD/VD невроните (Фигура 7C и 7D), което предполага, че е била предизвикана автофагия. Освен това излишните пунктове UNC-9: GFP са в непосредствена близост до или частично се припокриват със сигнала mCherry: LGG-1 (фиг. 7Е). Това показва, че излишъкът от UNC-9 протеин може да претърпи автофагия-медиирано разграждане. При липса на pmk-3, ire-1 или xbp-1, индукцията на автофагия в DD/VD е драстично намалена (фиг. 7D), което предполага, че пътят p38-IRE1-XBP1 е необходим за индукция на автофагия, предизвикана от излишък UNC -9: GFP.

Дискусия

Натрупването на екзогенни или анормални неправилно сгънати протеини в невроните допринася за патологията, свързана с невродегенерацията. Нашето разбиране за молекулярните събития, свързващи ER стреса с невродегенерацията, изисква по-задълбочено познаване на механизмите, които са в основата на ER хомеостазата, включително как генната транскрипция се активира и автофагията се регулира в специфични невронални клетки in vivo.

В отговор на ER стрес, транскрипцията на ER chaperone гена се активира от IRE-1/XBP-1 пътя [37]. В действителност, когато червеите са изложени на туникамицин или дитиотреитол (DTT) или на глобално неправилно нагъване на протеини, причинено от топлинен шок, GFP репортер, задвижван от промотора hsp-4, е силно индуциран в широк спектър от тъкани и клетки [9, 38] . Пан-невронният ER стрес също така предизвиква експресия на hsp-4 не-автономно в червата и хиподермите [39]. За разлика от предишни наблюдения обаче UNC-9: свръхекспресията на GFP в DD/VD моторни неврони предизвиква ER стрес само в DD/VD клетките. C. elegans съдържа 302 неврона и промоторът Punc-25 ограничава UNC-9: GFP свръхекспресията до по-малко от 30 неврона (най-вече DD и VD неврони). Въпреки че подробните механизми, лежащи в основата на този ограничен ефект, остават неуловими, възможно е широчината или/и тежестта на ER стреса в нервната система да определя дали стресовият отговор може да се разпространи в съседните тъкани.

Материали и методи

Генетика на C. elegans

ДНК конструкции и трансгенни животни

Промоторът unc-25 беше вмъкнат между BamHI и SphI сайтовете на pSM-GFP вектора (щедър подарък от д-р Kang Shen) и UNC-9 cDNA беше вмъкнат в BamHI сайта. xbp-1, ire-1 и pmk-3 кДНК се амплифицират чрез обратна транскрипция. ER плазмидът за репортер на стрес Punc-25: XBP-1us: mCherry е модифициран от плазмида XB3 (щедър подарък от д-р Кристофър Ронго). Punc-25: cytb-5.1: mCherry беше любезно предоставен от д-р Yingchuan Qi. Punc-25: mCherry: MANS, Punc-25: mCherry: RAB-7, Punc-25: mCherry: RAB-5 и Punc-25: mCherry: LGG-1 са конструирани от метод на рекомбинация. Трансгенните животни са произведени, както е описано по-горе [59]. Интегрирани щамове са получени чрез UV облъчване. Щамът BCN1071, който експресира Phsp-4: mCherry, е любезно предоставен от Ben Lehner. Всички интегрирани трансгенни животни бяха кръстосани поне 3 пъти. Съответните трансгени са изброени в таблица S2.