Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Катедра по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, улици Елм и Карлтън, Бъфало, Ню Йорк, 14261 Търсене на още статии от този автор

Отдел за молекулярна и клетъчна биофизика, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел за превенция на рака и науките за популацията, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Катедра по биостатистика, Университет в Бъфало, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел за превенция на рака и науките за популацията, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отделение по гинекологична онкология, болница "Сейнт Винсент", Индианаполис, IN, САЩ

Отделение по гинекологична онкология, болница "Сейнт Винсент", Индианаполис, IN, САЩ

Х. Лий Мофит Център за рак и изследователски институт, Тампа, Флорида, САЩ

Отделение по гинекологична онкология, клиника Мейо, Рочестър, MN, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по патология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел за молекулярна и клетъчна биофизика, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Катедра по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, улици Елм и Карлтън, Бъфало, Ню Йорк, 14261 Търсене на още статии от този автор

Отдел за молекулярна и клетъчна биофизика, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел за превенция на рака и науките за популацията, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Катедра по биостатистика, Университет в Бъфало, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел за превенция на рака и науките за популацията, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отделение по гинекологична онкология, болница "Сейнт Винсент", Индианаполис, IN, САЩ

Отделение по гинекологична онкология, болница "Сейнт Винсент", Индианаполис, IN, САЩ

Х. Лий Мофит Център за рак и изследователски институт, Тампа, Флорида, САЩ

Отделение по гинекологична онкология, клиника Мейо, Рочестър, MN, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по патология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел по гинекологична онкология, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Отдел за молекулярна и клетъчна биофизика, Институт за рак на Розуел Парк, Бъфало, Ню Йорк, САЩ

Резюме

материали и методи

Събиране и подготовка на проби

От юли 2001 г. до декември 2002 г., предоперативни серумни проби на пациенти, подложени на операция за EOC в Института за рак на Розуел Парк (RPCI), бяха събрани съгласно одобрен протокол IRB. Проверката на патологията на туморната тъкан е извършена от гинекологичен патолог (M.E.I.). За контрол, серумите на нормални здрави жени (преди и след менопаузата) и от пациенти с доброкачествени кисти на яйчниците бяха събрани по 2 допълнителни протокола IRB. Серуми от здрави жени в пременопауза са събрани от жени, посещаващи гинекологичните клиники в онкологичния институт в Розуел Парк. За жени в постменопауза серумите са събрани от участници в проучване за интервенция в храненето. В рамките на 2 часа от събирането на кръв чрез венепункция, серумите се разделят чрез центрофугиране и аликвотни части се съхраняват при -80 ° C, докато се анализират.

1 H-NMR спектроскопски анализ на серумните проби

Намаляване на данните на NMR данни

Всеки 1 H-NMR спектър беше коригиран за фазово и базово изкривяване с помощта на NutsPro (версия 20021122, Acorn NMR Inc., Ливърмор, Калифорния) и спектралната област от 9,5–0,0 части на милион (ppm) беше намалена до 200–250 интегрални сегмента на равна ширина δ0.04. Тази оптимална ширина на сегментираните региони се основава на предишни проучвания, 20, 21, които установяват, че региони от 0,04 ppm приспособяват малки промени, свързани с рН в сигналите и вариации в качеството на блясъка. За да се елиминират всякакви фалшиви ефекти на променливостта при потискане на водния резонанс, регионът, съдържащ водния резонанс (δ5,5 до 4,75), беше зададен на нулев интеграл. Впоследствие всички останали честотни области на спектрите бяха мащабирани до общата интегрирана площ на спектрите, средноцентрирани и парето-мащабирани. 22 Мащабирането на Парето дава на всяка променлива вариация, числено равна на стандартното отклонение.

Анализ на основните компоненти (PCA) на 1 H-NMR спектрите

Меко независимо моделиране на аналогия на класа (SIMCA)

За да се осигури валидиране на резултатите, беше извършен контролиран анализ на данните въз основа на Soft Independent Modeling of Class Analogy (SIMCA). SIMCA използва характеристиките на PCA, за да изгради граници на значимост за определени класове проби в резултатите и остатъчната посока. Картирането на неизвестни проби върху изчислените модели осигурява идентичност на класа въз основа на сходство между неизвестните проби и пробите в предварително дефинираните модели на класове. Метод за визуализиране на подхода SIMCA е сюжетът на Cooman, 24, който нанася разстояния между класовете един срещу друг. Изградихме отделни PCA модели за серумите на пациенти с EOC, пациенти с доброкачествени кисти на яйчниците и здрави контроли в постменопауза. След това SIMCA беше приложен към моделите, използвайки парцела на Cooman, за да се оцени изпълнението на класификацията чрез прогнозиране на членството в класа по отношение на разстоянието от модела. Критичното разстояние от използвания модел съответства на ниво 0,05 и определя 95% интервал на толерантност.

Анализ на кривата на работната характеристика на приемника (ROC)

Въпреки че анализът на основните компоненти е отличен инструмент за намаляване на данните и следователно графично показване, той не се поддава на разработването на диагностичен модел за прогнозиране на наличие или отсъствие на заболяване. За да се справим с това, извършихме едномерни ROC анализи чрез индивидуални логистични регресии за всеки от 219 1 H-NMR региона, за да проучим тяхната полезност за прогнозиране на EOC. Компромисите за чувствителност и специфичност бяха обобщени за всяка променлива, като се използва площта под ROC кривата, обозначена като AUC и се изчислява, като се използва трапецовидното правило. Стойност на AUC 1,0 съответства на модел за прогнозиране със 100% чувствителност и 100% специфичност, докато стойност на AUC 0,5 съответства на лош предсказващ модел (вж. Pepe и др. 25 за преглед на анализите на ROC чрез моделиране на логистична регресия). След това бяха пригодени най-добрите модели с 2 променливи, започвайки от едномерната информация чрез стъпков подбор напред, използвайки AUC като критерии за влизане на променлива в модела. Поради високата степен на точност за 2-променлив модел, не сметнахме за необходимо да преминем към 3-променлив модел.

Анализ на разликите в спектралния модел

Въз основа на резултатите от ненаблюдавани PCA, контролирани SIMCA и ROC анализи, ние продължихме да идентифицираме молекулите, отговорни за разликите в спектралните модели, използвайки описана по-рано методология. 26 Областите от ЯМР спектъра, които най-силно влияят на разделянето между EOC и здравите контроли, бяха идентифицирани чрез регресионните коефициенти. Коефициентите са получени от моделите PCA, така че всяка лента представлява спектрална област, покриваща 0,04 ppm, показваща как 1 H-NMR профилът на EOC пробите се различава от 1 H-NMR профила на здравите серумни проби. Отрицателната стойност показва относително по-голяма концентрация на метаболит (присвоена с помощта на NMR таблици за разпределение на химически смени), присъстваща в пробите на EOC, а положителната стойност показва относително по-ниска концентрация по отношение на пробите на EOC.

Резултати

Характеристика на пациентите

Разпределението по етапи на 38-те пациенти с EOC беше както следва: етап I, 2 пациенти; етап IIIC, 34 пациенти; етап IV, 2 пациенти (Таблица I). Сред пациентите с напреднало заболяване (стадии IIIC и IV) 4 (11%) са имали нормални предоперативни серумни нива CA125 (Таблица I. Характеристики на пациентите и контролите

Характеристики Епителни пациенти с рак на яйчниците Пациенти с доброкачествено заболяване на яйчниците Постменопаузален контрол Пременопаузален контрол
Брой предмети 38 12 32 19.
Възраст (медиана/диапазон) 61 (46–86) 50 (22–68) 57 (51–69) 28 (22–44)
FIGO етап
IA - - - -
IB 1 - - -
интегрална схема 1 - - -
IIB - - - -
IIC - - - -
IIIA - - - -
IIIB - - - -
IIIC 34 - - -
IV 2 - - -
Хистология
Папиларен сероз 30 - - -
Изчистване на клетката 2 - - -
Ендометрид 2 - - -
Муцинозен 1 - - -
Недиференциран 1 - - -
Други (преходни, смесени) 2 - - -
Ендометриоза - 1 - -
Серозен цистаденом - 7 - -
Хеморагична функционална киста - 3 - -
Муцинозен цистаденом - 1 - -
Използване на орални контрацептиви Без документи
Някога 28 - 24 15
Никога 10 - 8 4
Паритет Без документи Без документи
0 8 - 5 -
1 5 - 3 -
2 8 - 7 -
3 7 - 7 -
4 7 - 6 -
≥5 2 - 4 -

1 H-NMR спектри на серуми от пациенти с EOC и контроли

След като бяха получени ЯМР спектрите, бяха анализирани параметрите на химичното изместване и интензивността на сигнала. Химичното изместване е разликата между конкретна резонансна честота и честота на избрана референция. Както е посочено по-горе, химичните измествания се изразяват по отношение на триметилсилил-2,2,3,3-тетрадеутеропропионова киселина и се изразяват в части на милион (ppm). Протоните на метиловата група резонират от 0,7–2,0 ppm в групите C-CH3, но от 2,1–3,5 ppm в групите N-CH3. Ароматните пръстенни протони ще резонират от 6,0–9,0 ppm. По този начин химичното изместване вече съдържа информация за молекулната структура и може да се използва за разграничаване на 1 H-NMR спектрите на молекулите, дори когато химическата им структура е малко по-различна. Публикувана е подробна информация за химичното изместване на различните химически групи, 27, 28 и химичните компоненти са присвоени на спектрите въз основа на тези публикувани данни. 29, 30 Фигура 1а показва 600 MHz 1 H-NMR спектри на серум от пациент в постменопауза с EOC на етап 1, Фигура 1б показва спектрите от здрав пациент в постменопауза, Фигура 1в показва спектрите от здрав пациент в пременопауза и Фигура 1д показва спектрите на пациент с доброкачествена киста на яйчника (ендометриоза на яйчниците).

епитела

Сравнение на пациенти с епителен рак на яйчниците (EOC) със здрави индивиди. 600 MHz 1 H-NMR спектрите на серумни проби от пациент с EOC след менопауза I етап (а), здрав субект в пременопауза (б) здрав субект след менопауза (° С) и пациент с доброкачествена киста на яйчниците (ендометриоза) (д). Посочени са химичните измествания на селекция от основни метаболити (въз основа на сравнение с публикуваните метаболити), 27 въпреки че тези метаболити не допринасят за целия (или в някои случаи, дори за повечето) от сигнала при посоченото химично изместване. Назначаването на аланин, валин, глюкоза и 3-хидроксибутират бяха потвърдени чрез добавяне на проби с референтни съединения.

За да се премахне всякаква неяснота в зададените стойности на химично изместване, пробата беше „добавена“ с малко количество от 3 референтни съединения, за да се тества дали може да се постигне перфектна суперпозиция на сигналите. Първо се добавя проба от аланин, последвана от валин и след това глюкоза със спектри, получени след всяко добавяне. Във всеки случай резонансите на еталона попадат директно върху зададените резонанси в биофлуида.

PCA анализ на 1 H-NMR спектри на серуми от пациенти с EOC и контроли

Намалените с данни 1 H-NMR-спектри са показани на фигура 2. Последващият анализ на PCA на набора от данни показва добра дискриминация между пациентите с EOC и контролите. По този начин успяхме правилно да отделим всички 38 проби от рак (100%) и всичките 21 нормални проби в пременопауза (100%) (Фиг. 3а). Освен това беше възможно да се разделят правилно 37 от 38 (97,4%) проби от рак и 31 от 32 (97%) проби от контролен серум в постменопауза (фиг. 3б). Когато пациенти с доброкачествено заболяване на яйчниците бяха включени в PCA анализа, все още беше възможно правилно да се отделят всички 38 проби от рак (100%) от серумите на всички 12 пациенти с доброкачествено заболяване на яйчниците (фиг. 3° С). Въпреки че серумите от пациенти с доброкачествено заболяване се припокриват със серуми от здравите контроли, беше възможно да се постигне разделяне на рака срещу. неракови случаи. Всички графици на PCA показват, че по-голямата част от вариацията е възникнала в първите 2 основни компонента. Тъй като по-голямата част от пациентите с EOC в нашето проучване и в клиничната практика са в постменопауза, ние избрахме да извършим допълнителен анализ чрез сравняване на доброкачествените и раковите пациенти със здрави контроли в постменопауза.

Намален с данни 1 H-NMR спектър на серумна проба от типичен пациент с рак на епителния рак на яйчниците. Областта между δ4,5 и δ6 е изтрита, за да се намали вероятността от някакъв принос на дисперсия от непълно потискане на водния сигнал.

PCA графики на факторни оценки за първите 2 основни компонента (t [1], t [2]), показващи значителното разделение, постигнато между (а) серумни проби от епителен рак на яйчниците (EOC) (X, ▪) и здрави контроли в пременопауза (▾); (б) EOC серумни проби (X, ▪) и здрави контроли в постменопауза (▾) и (° С) EOC серумни проби (X, ▪), здрави контроли в постменопауза (▾) и доброкачествени кисти на яйчниците (o). Имайте предвид, че във втория основен компонент е настъпило оптимално разделяне. Пациентите с IOC на I етап са обозначени с X.

SIMCA анализ

В допълнение към PCA анализа, към набора от данни беше приложен надзиран анализ, състоящ се от Soft Independent Modeling of Class Analogy (SIMCA). Полученият парцел на Cooman демонстрира, че класовете на серуми от пациенти с EOC, доброкачествени кисти на яйчниците и здрави контроли в постменопауза не споделят многовариантно пространство, осигурявайки валидиране за разделянето на класовете (Фиг. 4). Следователно трябва да е възможно да се предскаже дали бъдещите проби могат да бъдат класифицирани като рак или неракови заболявания. Тези предварителни данни показват, че метабономният анализ на серумни проби, базиран на 1 H-NMR, може да постигне клинично полезно представяне за идентифициране на серумни проби на пациенти с EOC.

Сюжетът на Cooman демонстрира, че класът на серумите на епителния рак на яйчниците (EOC) (X, ▪), серумите от пациенти с доброкачествено заболяване на яйчниците (o) и контролните серуми в постменопауза (▾) не споделят многовариантно пространство. Пациентите с IOC на I етап са обозначени с X.

ROC анализ

ROC анализът, използвайки суровите данни за местоположението, показа, че 2-променлив модел, състоящ се от 1 H-NMR дескриптори при 2,77 и 2,04 ppm, осигурява перфектен модел на напасване, т.е., AUC = 1,0. На фигура 5 е представен разпръснат график, който ясно илюстрира очертанието между 2-те групи. За отбелязване е, че едномерният модел, който разглежда само региона 2,04 ppm, дава AUC = 0,942, докато AUC за едномерния модел за регион 2,77 ppm AUC = 0,689, т.е., прогнозата въз основа на регион 2.04 се засилва в зависимост от информацията, съдържаща се в регион 2.77 ppm.

Скатерна графика и ROC анализ на H-NMR метабономен профил на серуми от здрави контроли в постменопауза (затворени кръгове) и рак на епитела на яйчниците (отворени кръгове).

Влиятелни натоварвания, отговорни за спектралните разлики между серумите от пациенти с EOC и контролите

(а) Коефициентите на регресия за NMR сигнали корелират с втория компонент на PCA, показан на Фигура 3. Сравнението на серуми от пациенти с епителен рак на яйчниците (EOC) и здрави жени в постменопауза. Отрицателните коефициенти показват относително по-високи стойности за тази спектрална област в EOC пробите в сравнение със здравите проби, докато положителните коефициенти показват по-ниски стойности. Величината на коефициента представлява относителната важност на всеки контейнер за данни за разделянето, постигнато в модела PCA. (б) Коефициенти на регресия на първия компонент на PCA, показан на Фигура 3. Сравнението на серуми от пациенти с EOC и здрави жени в пременопауза. Отрицателните коефициенти показват относително по-високи стойности за тази спектрална област в EOC пробите в сравнение със здравите проби, докато положителните коефициенти показват по-ниски стойности. Величината на коефициента представлява относителната важност на всеки контейнер за данни за разделянето, постигнато в модела PCA.

Дискусия