Пчелното млечице забавя двигателното функционално увреждане по време на стареене при генетично хетерогенни мъжки мишки

bg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

Нобуаки Окумура

1 Институт за пчелни продукти и здравни науки, Yamada Bee Company, Inc., Окаяма 708-0393, Япония; moc.eeb-adamay@0871on (N.O.); moc.eeb-adamay@0431it (T.I.); moc.eeb-adamay@0880tt (T.T.); moc.eeb-adamay@3660hk (K.H.)

Тошихико Тода

2 Катедра по клинична клетъчна биология и медицина, Медицински факултет на Университета Чиба, Чиба 260-8670, Япония; pj.emoetorp@adot_kih (T.T.); moc.liamg@3ekusuyawazo (YOO); [email protected] (К.В.)

Юсуке Одзава

Кенджи Уатанабе

Томоки Икута

Томоки Татефуджи

Кен Хашимото

Такахико Шимизу

Свързани данни

Резюме

1. Въведение

В застаряващите общества по света броят на възрастните хора, страдащи от свързани с възрастта заболявания, като двигателни нарушения, метаболитен синдром и когнитивен спад, се увеличава [1,2,3,4]. Тези заболявания са пряко свързани с намалено качество на живот (QOL), което поражда разлика между продължителността на живота и здравословния живот. За да се преодолеят тези проблеми, се очаква диетичните интервенции, като диетични ограничения, лекарства и хранителни вещества, да забавят скоростта на стареене и да доведат до здравословно стареене [5,6].

При медоносната пчела (Apis mellifera) пчелното млечице (RJ) определя епигенетични промени, водещи до различни съдби при пчелите работнички и дълголетните пчели майки с идентични генотипове [7,8,9,10]. RJ се произвежда от хипофарингеалната и долночелюстната жлеза на кърмещите пчели. RJ може да бъде хранителна храна с активност на удължаване, защото добавянето на ларви на пчелни пчели с RJ индуцира развитие в пчелна майка, която има характерно по-голямо тяло и по-дълъг живот от работниците [11]. В допълнение, RJ и неговите съставки са идентифицирани като фактори за удължаване на живота от други проучвания с използване на безгръбначни [12,13,14,15]. Съобщава се също, че RJ удължава живота на мишките C3H/HeJ [16]. RJ се очаква да смекчи здравословната продължителност на живота при хората, тъй като се съобщава, че има различни ползи за здравето, като насърчаване на дълголетието, антидепресия, анти-сухо око, анти-затлъстяване и анти-саркопения в животински модели както и при хората [16,17,18,19,20,21]. Следователно, RJ е вещество кандидат за удължаване на продължителността на здравословния живот. Въпреки това, ефектите от доживотно лечение с RJ върху здравословния живот по време на нормалното стареене не са напълно изяснени.

Съобщава се, че някои индивиди се подлагат на анафилактичен отговор след добавяне на RJ. За да преодолеем този проблем, преди това сме разработили ензимно третиран RJ (ERJ). Чрез лечение на RJ с алкални протеази, алергичната реакция към RJ е намалена без хранителна загуба на минерали, витамини и RJ-специфични мастни киселини като 10-хидрокси-2-деценова киселина (10-HDA) [22]. Не е изяснено обаче дали здравните ползи от RJ се запазват след лечение с протеаза.

За да се идентифицират съединенията, които забавят стареенето, са използвани експериментални животински модели. Многобройни проучвания съобщават за констатации за удължен живот на мишки [23]. Тези проучвания обаче са проведени върху мишки с еднакъв генетичен произход; следователно трябваше внимателно да преценим дали ефектите върху продължителността на живота зависят от генотипа или не. През последните години се използва генетично хетерогенен (HET) модел на мишка за изследване на агенти, които се очаква да увеличат продължителността на живота в програмите за тестване на интервенции (ITP), провеждани от Националния институт за стареене (NIA) [24]. Моделът HET има няколко предимства пред други модели в изследванията на стареенето. Тъй като HET мишките се генерират от четири различни самородни щамове (BALBc, C57BL/6, C3H и DBA/2), те имат генетично разнообразие и показват различни причини за смърт, подобни на човешките популации. В ITP са изпитани повече от 10 съединения с помощта на модела HET на мишка [25], като е установено, че само рапамицин увеличава дълголетието както при мъжките, така и при женските животни [26]. Хранителните съставки, като ресвератрол, екстракт от зелен чай, куркумин, триглицериди със средна верига и рибено масло, не успяха да удължат живота или здравословния живот [27,28].

В настоящото проучване изследвахме ефектите на RJ върху продължителността на живота и здравословния живот, използвайки HET мишки. Сравнихме ефектите на дълголетието на нормалното пчелно млечице (NRJ) и ERJ. За да изясним ефектите от лечението през целия живот с RJ, започнахме лечението, когато мишките бяха на шест месеца. Проведохме различни тестове за физическа работоспособност при мишки, за да оценим способността на RJ да удължи здравословния живот на животните.

2. Материали и методи

2.1. Производство и поддръжка на мишки

Всички експерименти с животни, извършени в това проучване, са одобрени от комисията по етика на университета Чиба въз основа на техните вътрешни насоки. Генетично хетерогенни четирипосочни кръстосани мишки са произведени в университета Чиба, както е описано по-рано [24]. Фоновите щамове на мишката, BALB/cCrScl, C57BL/6NCrSlc и CB6F1/Slc (F1 хибрид между женски BALB/cCrScl и мъжки C57BL/6NCrSlc), са получени от Japan SLC Inc. (Shizuoka, Япония). Първо съчетахме мъжки DBA/2CrSlc с женски C3H/HeSlc, за да получим F1 хибрид C3D2F1/CU. След това чифтосвахме мъжки C3D2F1/CU с женски CB6F1/Slc, за да създадем генетично хетерогенни мишки (допълнителна фигура S1). Мишките се отбиват на възраст от 4 седмици и след това се настаняват в пластмасова клетка при 5-6 мишки/клетка при 12-часов цикъл светлина-тъмнина при стайна температура. Мишките получиха безплатен достъп до вода с пластмасова бутилка и хранеха MF гранулирана диета (Oriental Yeast Co., Ltd., Токио, Япония) ad libitum.

2.2. Експериментална диета и лечение на RJ

Лиофилизиран суров RJ (необработен ензим RJ (NRJ, партида № YRP-M-140830) и ензимно третиран RJ (ERJ, партида № YDP-M-140423)) са приготвени в Yamada Bee Company, Inc. (Okayama, Япония). RJ беше стандартизиран с количествата специфични мастни киселини (E) -10-хидрокси-2-деценова киселина (10H2DA) и 10-хидроксидеканова киселина (10HDA): NRJ съдържаше минимум 3.8% от 10H2DA и минимум 0.6% от 10HDA, докато ERJ съдържа минимум 3,5% от 10H2DA и минимум 0,6% от 10HDA. Експерименталните диети бяха приготвени чрез пълно смесване на лиофилизиран RJ с диета на прах MF (ориенталски дрожди) в концентрация или 0,05% (ниска доза), или 0,5% (висока доза) (v/v). Общият състав на експерименталните диети е показан в допълнителна таблица S1. Съставите на всяка диета са изчислени от производствената информация за MF прахообразна диета, NRJ и ERJ.

В това проучване използвахме мъжки хетерогенни мишки. На 6-месечна възраст мишките бяха разделени на случаен принцип в пет групи, а именно Control (n = 66), 0,05% NRJ (NRJL, n = 62), 0,5% NRJ (NRJH, n = 66), 0,05% ERJ ( ERJL, n = 64) и 0,5% ERJ (ERJH, n = 66), и им беше дадена експериментална диета ad libitum по това време. Диетата се освежаваше два пъти седмично.

2.3. Тестове за физическа работоспособност

Сравнение на кривите на оцеляване между контролни и третирани с пчелно млечице мишки. За оценка на средната продължителност на живота е използван анализ на Каплан-Майер. Стрелката показва началото на лечението с RJ. Белите върхове на стрелките показват времето, в което е тествано физическото представяне на мишките. Сивите върхове на стрелки показват времето, в което мишките са били жертвани, за да получат проби за експериментите. Напред: контрол; NRJL: нелекувана с ензими RJ ниска доза; NRJH: нелекувана с ензими RJ висока доза; ERJL: ензимно третирана RJ ниска доза; ERJH: ензимно третиран RJ с ниски високи дози.

2.4. Колекция кръв и тъкани

Пълна кръв се събира на 10 и 24 месечна възраст след 18 часа на гладно под анестезия (комбинация от пентобарбитал и етер). Броят на кръвните клетки веднага се измерва след вземане на кръв с автоматичен хематологичен анализатор (Celltac MEK-4150; Nihon Kohden, Токио, Япония). EDTA-плазмата също беше приготвена по едно и също време за анализ на биохимичните параметри на плазмата: плазмен албумин, аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT), общ холестерол (T-CHO) и триглицерид (TG). Тъканите бяха отстранени от мишки на възраст 9-10, 24 и 36-39 месеца (покажете Фигура 1, сиви върхове на стрелки). Всички тъкани бяха перфузирани с ледено охладен с фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS) преди отстраняване и след това се промиват с течен азот. Всички проби се съхраняват при -80 ° C до анализ.

2.6. Хистологични анализи

Скелетните мускули (гастрокнемиален мускул) бяха фиксирани с параформалдехид и бяха направени напречни сечения. За да се оцени общата хистология на мускулите, напречните сечения бяха оцветени с хематоксилин и еозин. Снимките са правени с флуоресцентната микроскопична система All-In-One, BZ-700 (Keyence, Осака, Япония). Площта на напречното сечение (CSA) на мускулните влакна и броят на централните ядра бяха анализирани с анализатор BZ-Z (Keyence).

2.7. Измерване на костната минерална плътност

Костната минерална плътност (КМП) е измерена на 9-10, 24 и 36-39 месечна възраст чрез използване на метод на рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия. Накратко, мишките бяха анестезирани с пентобарбитал и след това BMD на бедрената кост беше измерена с помощта на инструмента PIXImus (Lunar Corp., Madison, WI, USA).

2.8. Анализи на експресията на иРНК

Обща РНК беше извлечена от гастрокнемиусния мускул на 10 и 24 месечна възраст с TRIzol® РНК изолационни реактиви (Thermo Fisher Scientific K.K., Kanagawa, Япония). Общата РНК се третира с RQ-1 RNase free-DNase (Promega, Madison, WI, USA) за отстраняване на замърсената геномна ДНК. Концентрацията на общата РНК е определена количествено от NanoDrop (Thermo Fisher Scientific K.K). Един микрограм от обща РНК е транскрибиран обратно с ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix (Тойобо, Осака, Япония). Полимеразна верижна реакция в реално време (PCR) се извършва по метода на флуоресцентното багрило SYBR Green, използвайки SsoAdvanced ™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) с PCR система в реално време на Miniopticon ( Bio-Rad Laboratories). Двойките грундове, използвани в този експеримент, са показани в допълнителна таблица S4. Оценихме стабилността на пет кандидати за референтен ген, използвайки алгоритъма “NormFinder” [29]: B2m, Actb, H2a, Gurb и Rsp18. Избрахме H2a като домакински ген, тъй като той показа най-стабилната експресия в скелетните мускули.

2.9. Статистически анализи

Всички статистически анализи бяха извършени с GraphPad Prism7. Данните бяха представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Статистическите различия между групите бяха анализирани чрез непараметричния тест на Крускал – Уолис (тест за множество сравнения на post-hoc Dunn). Ако се анализират две групи, значимостта се определя чрез U теста на Mann-Whitney’s. Кривите на оцеляване са изчислени по метода на Каплан-Майер, а статистическата разлика е определена чрез log-rank тест. Статистическият анализ на всеки експеримент е описан в легендите на фигурите.

3. Резултати

3.1. Прием на храна, телесно тегло и оцеляване

Общият състав и общите калории на експерименталните диети са сравними между групите (допълнителна таблица S1). Консумацията на храна постепенно намалява с възрастта във всички групи, но е сходна сред групите на същата възраст (допълнителна фигура S2). Изчислихме приема на RJ от стойностите на консумацията на храна. Мишките консумират RJ при приблизително 50 mg/kg телесно тегло/ден в групата с нисък RJ и 500 mg/kg телесно тегло/ден в групата с висок RJ по време на експериментите (допълнителна фигура S2a, десен панел). Измервахме телесното тегло всеки месец от шестмесечна възраст (началото на лечението с RJ). Теглото на тялото достигна връх около 15-месечна възраст (9 месеца след лечението с RJ) и след това постепенно намалява по време на процеса на стареене. Телесното тегло в групата на ERJL е значително по-ниско от 14 до 22-месечна възраст, отколкото в контролната група, но не проучихме причините за това намаляване на теглото. Няма значителни промени в телесното тегло в останалите групи (допълнителна фигура S2b). След това оценихме ефекта на RJ върху оцеляването (Фигура 1). Високите дози RJ (NRJH и ERJH) не повлияват средната продължителност на живота. RJ с ниска доза не показва изразен ефект върху оцеляването. Не забелязахме никакви опасения за безопасността, свързани с лечението с RJ, при нашата оценка на плазмените биохимични параметри и кръвни клетки (допълнителни таблици S2 и S3).

3.2. Ефекти на RJ върху възрастово зависимото увреждане на физическата работоспособност

Пчелното млечице подобрява свързаното с възрастта увреждане на двигателната функция при генетично хетерогенни мишки. Силата на сцепление беше измерена чрез изпитване на пружинен габарит (а) и тест на окачване на тел (б). Локомоторната активност е измерена чрез хоризонтален тест (° С) и ускорен ротарод тест (д). Данните са показани като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM) (n = 14–18 за 30–33 месеца или n = 4–7 за 36–39 месеца). ** P Фигура 3, бяла стрелка). Тези атрофични характеристики на мускулите обаче бяха отслабени при мишки, третирани с RJ (Фигура 3). Честотният пик на площта на напречното сечение на влакната (CSA) се измества от 1800 до 1200 µm 2 с възрастта (Фигура 3 i). Обаче влакната остават големи (повече от 2100 µm 2) при третирани с RJ мишки (Фигура 3 i). Средният CSA на фибри също е намален при възрастни контролни мишки, но не се различава значително от този при мишки, третирани с RJ (Фигура 3 j). Освен това, значителното увеличаване на разпространението на центронуклеарни миофибри с възрастта има тенденция да намалява при третирани с RJ мишки на възраст (Фигура 3 к). Тези резултати показват, че RJ леко повлиява свързаните с възрастта морфологични промени в мускулните влакна.

Ефекти на RJ върху свързаните с възрастта морфологични промени в мускулните влакна при генетично хетерогенни мишки. A – D, Морфология на мускулните влакна на гастрокнемиума (оцветяване с хематоксилин-еозин (H & E)) на млади (а,д), на възраст (б,е), на възраст, лекуван с NRJ (° С,ж), и на възраст ERJ, лекувани (д,з) мишки. Горните панели показват ниско увеличение (а-д), а долните панели показват голямо увеличение (д,е). Влакна с центронуклеуси са наблюдавани при възрастни мишки (вижте върховете на стрелките на фигурата). Възпалителната клетъчна инфилтрация се обозначава с бялата стрелка. Лентата показва 100 µm. (i), Разпределение на областите на напречното сечение (CSA) на мускулите на стомашно-чревния мускул. ** P Фигура 4). След това изследвахме ефектите на RJ върху гените за мускулна диференциация MyoD и миогенеин [31] и регулатора на мускулния растеж миостатин [32]. Няма значителни разлики в експресията на MyoD, миогенин и миостатин сред групите (Фигура 4). Също така изследвахме ефектите на RJ върху експресията на мускулно специфичните E3 убиквитинови лигази MuRF1 и атрогин-1 (известни също като MAFbx), за които се съобщава, че са увеличени в различни модели на мускулна атрофия, включително модели на стареене [33]. Ние потвърдихме, че както MuRF1, така и атрогин-1 значително се увеличават с възрастта при HET мишки. Въпреки това, при мишки, третирани с RJ, експресиите на MuRF1 и атрогин-1 са подобни на тези при млади мишки (Фигура 4). Тези резултати предполагат, че RJ забавя възрастово зависимата дерегулация на мускулното качество чрез регулиране както на мускулната регенерация, така и на катаболните гени.

5. Заключения

В настоящото проучване показахме, че RJ отслабва прогресията на свързания с възрастта спад на двигателната функция, използвайки HET мишки. RJ повлиява хистологичните и молекулярните промени, които обикновено се случват с възрастта в мускулите, което предполага, че RJ засяга предимно мускулното качество пред мускулното количество. Тези резултати показват, че RJ може да бъде полезен за подобряване на QOL чрез отслабване на свързаното с възрастта нарушение на двигателната функция.

Благодарности

Благодарим на Шуичи Шибуя и Наотака Идзуо (Катедра за напреднала медицина на стареенето, Медицински факултет на Университета Чиба, Чиба, Япония) за полезната дискусия. Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Yamada Bee, Ltd.

Популярен

Те четат сега