Heyjun Park, Madeleine R Wood, Olga V Malysheva, Sara Jones, Saurabh Mehta, Patsy M Brannon, Marie A Caudill, Плацентарният метаболизъм на витамин D и неговите асоциации с циркулиращите метаболити на витамин D при бременни жени, The American Journal of Clinical Nutrition, Volume 106, Брой 6, декември 2017 г., страници 1439–1448, https://doi.org/10.3945/ajcn.117.153429
РЕЗЮМЕ
Заден план: Малко се знае за метаболизма на витамин D в плацентата и неговото въздействие върху концентрациите на витамин D при майката при хората.
Обективен: Това проучване се стреми да подобри сегашното разбиране за метаболизма на витамин D в плацентата и неговата роля в модулирането на метаболитите на витамин D при майката по време на бременност.
Дизайн: Вложен в рамките на проучване за хранене, 24 здрави бременни жени (26-29 седмици от бременността) консумират едно количество витамин D (511 IU/ден от диетата и добавка на холекалциферол) в продължение на 10 седмици. Количествено са изчислени концентрациите на метаболити на плацентата и кръвта на витамин D и плацентарната РНК (mRNA) на метаболитните компоненти на витамин D. Освен това култивираните човешки трофобласти бяха инкубирани с 13 С-холекалциферол, за да се изследва вътреклетъчното генериране и секреция на метаболити на витамин D заедно с регулирането на целевите гени.
Резултати: В плацентарната тъкан 25-хидроксивитамин D3 [25 (OH) D3] е силно корелиран (r = 0.83, P
ВЪВЕДЕНИЕ
По време на бременността при човека са наблюдавани значителни промени в циркулиращите концентрации на метаболити на витамин D и свързаните с тях протеини. Например, циркулиращите концентрации на 1,25-дихидроксивитамин D3 [1,25 (OH) 2D3], биоактивен метаболит на витамин D и протеин, свързващ витамин D (DBP), носител за циркулиращи метаболити на витамин D, са показали, че увеличаване с 1,5–2,0 пъти през бременността (1–4). По подобен начин се увеличава 25-хидроксивитамин D3 [25 (OH) D3] (2, 5–7), основната форма на витамин D в кръвта и C3 епимерът на 25 (OH) D3 [3-epi-25 (OH) D3] (7–9) също са наблюдавани в някои проучвания. Независимо от това, основните механизми на тези предизвикани от бременността промени в циркулиращите метаболити на витамин D са до голяма степен неизвестни.
За да се подобри сегашното разбиране за метаболизма на витамин D в плацентата и неговото въздействие върху концентрациите на витамин D при майката при хората, това проучване изследва връзките на биомаркерите на метаболизма на витамин D в плацентарната тъкан с майчината кръв, получена от бременни жени, участващи в дългосрочен план проучване за контролирано хранене. Бяха изследвани и връзките на плацентарните метаболити на витамин D с плацентарната експресия на метаболизиращи гени на витамин D. В допълнение, модел на човешка плацентарна клетъчна култура е използван за изследване на поглъщането на 13 С-белязан холекалциферол и неговата метаболитна съдба и въздействието на холекалциферола върху изобилието на целевите генни транскрипти.
МЕТОДИ
Изследване на човешкото хранене
Дизайн на проучването, участници и събиране на проби
Измервания на метаболит на витамин D в кръвта и плацентата
Количествено определихме серум 25 (OH) D3, серум 3-epi-25 (OH) D3 и плазма 24,25 (OH) 2D3 с използването на стабилна изотопна разреждаща течна хроматография – тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS) методология, която беше валидирана отчасти чрез участие в схемата за оценка на външното качество на витамин D, както беше описано по-рано (7). Концентрациите на плазма 1,25 (OH) 2D3 (имунодиагностични системи) и DBP (системи за научноизследователска и развойна дейност) се определят количествено чрез използване на ELISA комплекти. Оценката на концентрациите на свободен 25 (OH) D3 беше извършена с помощта на предварително публикувано уравнение (25).
Плацентарни 25 (OH) D3 и 24,25 (OH) 2D3 се екстрахират от хомогенизирани плацентарни тъкани (0,4 g) в 1 ml метанол след екстракция течност-течност (добавяне на 600 μL ацетонитрил, 1 ml метил трет-бутилов етер и 25 μL вътрешен стандарт), екстракция в твърда фаза с използване на патрони Oasis HLB (3 cc/60 mg) и дериватизация с 50 μL 0,1 mg/ml 4- (2- (6,7-диметокси-4-метил -3-оксо-3,4-дихидрохиноксалинил) етил) -1,2,4-триазолин-3,5-дион (26, 27). Вътрешен стандартен разтвор, съдържащ 215 μmol d3-25 (OH) D3/L (IsoSciences) и 1.7 μmol d6-24,25 (OH) 2D3/L (Toronto Research Chemicals Inc.) беше добавен към хомогенизираните тъкани в началото на екстракцията (27). Екстрактите се суспендират отново в 110 μL от разтвор на метанол-вода 60:40 и се инжектират върху LC-MS/MS система за количествено определяне на метаболитите на витамин D. LC-MS/MS условията следваха протокола за циркулиране на 24,25 (OH) 2D3 (7).
Генотипиране
Генотиповете на единичните нуклеотидни полиморфизми в метаболизиращи гени на витамин D [т.е. гени CYP2R1 и DBP] бяха определени от софтуера за генотипиране EndPoint на Roche LightCycler 480 с помощта на Applied Biosystems TaqMan Genotyping Assays (Life Technologies), както е описано по-горе (7 ).
Количествено определяне на РНК на компонентите на метаболитния път на витамин D в плацентарните тъкани
РНК се извлича от плацентарни тъканни проби с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen) и концентрациите се определят с помощта на инструмент NanoDrop ND-1000. Обратната транскрипция беше извършена с използването на комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Thermo Fisher Scientific) и беше проведена количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR) (система Applied Biosystems ABI 7300). Анализите за генна експресия на TaqMan (Thermo Fisher Scientific) са Hs00167999_m1 (CYP24A1), Hs00168017_m1 (CYP27B1), Hs01379776_m1 (CYP2R1), Hs01119018_g1 (LRP2) и Hs00153 C7N Реакционните условия бяха 50 ° С за 2 минути, 95 ° С за 10 минути и 40 цикъла от 95 ° С за 15 s и 60 ° С за 1 минута. Въз основа на метода на прага на цикъла 2 ΔΔΔ (28), данните за целевите гени бяха изразени като кратни промени в изобилието на пратеника РНК (mRNA), които бяха нормализирани към домакинския ген [β-глюкуронидаза (Hs99999908_m1)] и спрямо калибратор.
In vitro модел на плацентарна трофобластна клетъчна култура
HTR-8/SVneo клетъчна култура
Клетките HTR-8/SVneo (обезсмъртени човешки плацентарни екстравилозни трофобласти през първия триместър) са подарък от Чарлз Х. Греъм (University of Queen) (29). Клетките (пасажи с номера 17-21) се поставят върху културален съд (BD Biosciences) при плътност на засяване 1,39 × 106 клетки/съд и се култивират в стандартна среда RPMI 1640, която съдържа 1,25-5% фетален говежди серум, 2 тМ L-глутамин (всички от Corning Life Sciences) и всяко лечение с витамин D [т.е. 13 С2-холекалциферол или 13 С5-25 (ОН) D3; немаркиран холекалциферол, 25 (OH) D3 или 1,25 (OH) 2D3] при 37 ° C във влажна атмосфера от 5% въглероден диоксид и 95% въздух. Сто процента етанол беше добавен към стандартната среда, за да служи като контролна обработка (0.1% етанол). Броят на клетките и жизнеспособността се определят в два екземпляра, като се използва съответно брояч на клетки TC10 (Bio-Rad) и тест за изключване на трипан синьо. Експериментът се повтаря 3 пъти. В рамките на всяка репликация, всяко лечение се извършва в три екземпляра.
Немаркирано лечение с витамин D и qRT-PCR на метаболитни ензими на витамин D
За да се изследват ефектите от експозицията на витамин D върху реакцията на генна експресия на метаболитни ензими на витамин D в плацентата, клетките HTR-8/SVneo се култивират в продължение на 72 часа с немаркирани форми на холекалциферол, 25 (OH) D3 или 1,25 ( ОН) 2D3. Крайните концентрации на витамин D при всяко лечение са 2500, 5000 и 10 000 nM холекалциферол (Cayman Chemical), 500 nM 25 (OH) D3 (Cayman Chemical) и 100 nM 1,25 (OH) 2D3 (Sigma-Aldrich).
Клетъчните пелети от всяка проба бяха събрани и общата РНК беше извлечена (PerfectPure RNA Cell and Tissue Kit), количествено определена и подложена на обратна транскрипция и qRT-PCR. Анализите на TaqMan за генна експресия за CYP24A1, CYP27B1, CYP2R1 и β-глюкуронидаза, заедно с реакционните условия и метода за експресия на данни са същите като описаните по-горе в qRT-PCR протокола, използван за плацентарните тъкани.
13 C2-холекалциферол и 13 C5-25 (OH) D3 лечения и 13 C-маркирани витамин D метаболит измервания от клетки и среда
За да се изследва метаболитната съдба на холекалциферол, клетките HTR-8/SVneo се култивират в продължение на 24-, 72- и 96 часа или с 13 С2-холекалциферол (Cambridge Isotope Laboratories), или с 13 C5-25 (OH) D3 (IsoSciences LLC), което води до крайни концентрации съответно от 5000 или 500 nM. Тези концентрации на дозиране на 13 C2-холекалциферол и 13 C5-25 (OH) D3 са избрани с помощта на данни от немаркираното лечение с витамин D. Проба от всяко третиране във всеки момент от културата се състои от клетъчни пелети и среда, събрани от 3 ястия с култура. Клетъчните пелети и среда от всяка проба се събират поотделно и се съхраняват при -80 ° C до измерването.
Статистически анализ
Всички анализи бяха проведени с помощта на софтуера JMP Pro 12 (SAS Institute), STATA версия 14 (StataCorp) и SigmaPlot версия 11 софтуер (Systat Software). Данните, които обикновено не се разпределят, са преобразувани в ln и са представени като аритметични средни ± SD или геометрични средни (95% CI), освен ако не е посочено друго. Стойностите на Р са двустранни тестове и се считат за значими в таблица 1 и Допълнителна таблица 2 , и тези с ниво на значимост P ТАБЛИЦА 1
Изходни характеристики и гестационни резултати при бременни жени през третия триместър 1
| Възраст, y | 29 ± 3 |
| ИТМ при бременност, kg/m 2 | 24 ± 3 |
| Етническа принадлежност, n | |
| Кавказки | 14. |
| афроамериканец | 1 |
| латино | 4 |
| Азиатски | 4 |
| Други | 1 |
| Паритет, n | |
| Примипарас | 11. |
| Мултипара | 13 |
| Използване на мултивитаминни добавки преди влизане в проучването, n | |
| Да | 20. |
| Не | 4 |
| Сезон при влизане в обучението, n | |
| Април до септември | 13 |
| От октомври до март | 11. |
| GC rs7041 G> T полиморфизъм, n | |
| GG | 8 |
| GT | 10 |
| TT | 6 |
| CYP2R1 rs10741657 A> G полиморфизъм, n | |
| АА | 4 |
| AG | 18. |
| GG | 2 |
| CYP2R1 rs12794714 A> G полиморфизъм, n | |
| АА | 5 |
| AG | 18. |
| GG | 1 |
| Продължителност на бременността, седмица | 39,9 ± 0,7 |
| Гестационно наддаване на тегло, кг | 15,9 ± 4,6 |
| Начин на доставка, n | |
| Вагинално | 17 |
| Цезарово сечение | 5 |
| Възраст, y | 29 ± 3 |
| ИТМ при бременност, kg/m 2 | 24 ± 3 |
| Етническа принадлежност, n | |
| Кавказки | 14. |
| афроамериканец | 1 |
| латино | 4 |
| Азиатски | 4 |
| Други | 1 |
| Паритет, n | |
| Примипарас | 11. |
| Мултипара | 13 |
| Използване на мултивитаминни добавки преди влизане в проучването, n | |
| Да | 20. |
| Не | 4 |
| Сезон при влизане в обучението, n | |
| Април до септември | 13 |
| От октомври до март | 11. |
| GC rs7041 G> T полиморфизъм, n | |
| GG | 8 |
| GT | 10 |
| TT | 6 |
| CYP2R1 rs10741657 A> G полиморфизъм, n | |
| АА | 4 |
| AG | 18. |
| GG | 2 |
| CYP2R1 rs12794714 A> G полиморфизъм, n | |
| АА | 5 |
| AG | 18. |
| GG | 1 |
| Продължителност на бременността, седмица | 39,9 ± 0,7 |
| Гестационно наддаване на тегло, кг | 15,9 ± 4,6 |
| Начин на доставка, n | |
| Вагинално | 17 |
| Цезарово сечение | 5 |
Стойностите са средни стойности ± SD, освен ако не е посочено друго. CYP2R1, 25-хидроксилазен ген; GC, витамин D свързващ протеин ген.
- Метаболизъм и чернодробна безгранична анатомия и физиология
- Метаболизъм засилва тънката дебела диета
- Популярни митове за метаболизма и 9 лесни начина да го обогатите!
- Метаболизъм при бебета и деца 0-5 години
- RJ-ROBBINS Калциев метаболизъм и камъни в урината