3D модел и аминокиселинна последователност на Lst-HDD. (А) Теоретичен модел на хомодимера Lst-HDD. Лизостафиновият каталитичен домен е оцветен в зелено, лизостафиновият пептидогликан-свързващ домен е оцветен в циан, димеризационният домен е оцветен в синьо, а дистанционерът е оцветен в жълто. Моделът е конструиран в PyMOL (Schrödinger LLC, САЩ) въз основа на PDB запис 4LXC. (B) Аминокиселинната последователност на Lst-HDD. Цветовата схема като в (А).

пълнотекстови

SDS-PAGE и хроматография за изключване на размера (SEC) на Lst-HDD. (A) SDS-PAGE на пречистен лизостафин (път 1) и Lst-HDD (път 2); лента М съдържа стандарти за молекулно тегло с техните молекулни тегла, посочени вляво (B) SEC хроматограма на Lst-HDD. Входът показва калибриране на молекулното тегло на колоната.

Изчистване на S. aureus ATCC 29,213 клетъчна суспензия поради различни концентрации на лизостафин (A) или Lst-HDD (B). Концентрациите на лизостафин са 2 ug/mL (синьо), 1 ug/mL (оранжево), 0.5 ug/mL (сиво), 0.25 ug/mL (жълто) и контрол без лизостафин (черен); Концентрациите на Lst-HDD са 12 µg/ml (синьо), 6 µg/ml (оранжево), 3 µg/ml (сиво), 1,5 µg/ml (жълто), 0,75 µg/ml (светло синьо), 0,38 µg/ml (зелено) и управление без Lst-HDD (черно). Показани са средните стойности на n = 3 (лизостафин) или n = 2 (Lst-HDD) експерименти, лентите за грешки представляват стандартно отклонение.

Остатъчни концентрации на лизостафин (синьо, кръгчета) и Lst-HDD (оранжево, триъгълници) в плазма на плъхове. Показани са средните стойности за п = 4 плъхове, лентите за грешки представляват стандартно отклонение.

Резюме

1. Въведение

5 часа и 11,3 часа, съответно [22]. Бързата скорост на елиминиране на антибактериалните лизини води до необходимостта от многократно приложение и/или по-големи дози от протеина, за да се постигне ерадикация на бактериите [23,24]. По този начин би било желателно да се създадат варианти на лизин с увеличено време на престой в системната циркулация.

2. Резултати и дискусия

2.1. Създаване на димеризирана версия на лизостафин

2.2. Lst-HDD Преобладаващо съществува като димер

16 kDa. Първите два пика вероятно съответстват на димерните и мономерните видове на Lst-HDD, съответно. Въпреки че техните изчислени молекулни маси са

35 kDa, разликата вероятно може да се отдаде на предполагаемо удължената форма на Lst-HDD, което го кара да се елуира по-бързо от глобуларните протеини със съответно молекулно тегло. По този начин Lst-HDD наистина успя да се димеризира, въпреки че не всички молекули образуваха димери. Въпреки това, подвижната фаза в експериментите за хроматография с изключване на размера съдържа 0,5 М NaCl. Високата концентрация на сол отслабва електростатичните взаимодействия. Тъй като електростатичните взаимодействия играят съществена роля в димеризацията на избрания димеризационен домейн [33], се очаква по-висок дял на димеризираните Lst-HDD молекули при условия на ниско съдържание на сол. Алтернативно, причината за непълната димеризация на Lst-HDD може да бъде неправилното сгъване на част от молекулите.

2.3. Бактериолитичната, но не каталитичната активност на лизостафина се влияе от димеризацията

2.4. Димеризацията подобрява фармакокинетичните характеристики на лизостафина

50 µg/ml. Обаче останаха само 2.8 ± 0.2 µg/mL лизостафин и 1.6 ± 0.1 µg/mL Lst-HDD в първата точка за вземане на проби 25 минути след инжектирането. По този начин,

3. Материали и методи

3.1. Клониране, експресия и пречистване

3.2. Хроматография за изключване на размера

3.3. Каталитична активност

3.4. Минимална инхибираща концентрация

3.5. Стафилолитична активност

1,2 х 109 CFU/ml) и 180 uL от суспензията се прехвърлят в ямките на 96-ямкова плака. Плаката се инкубира при 37 ° С и 400 оборота в минута в продължение на 10 минути и към ямките се добавят 20 ul различни концентрации на лизостафин или Lst-HDD. Мътността на суспензията се наблюдава в продължение на 1 h при 37 ° C с бавно разклащане, като се правят измервания на интервали от 1 min при дължина на вълната 550 nm, използвайки Multiscan FC четец за микроплаки (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). Измерванията за всяка концентрация на протеин в рамките на експеримента се извършват в три екземпляра и експериментът се извършва три (лизостафин) или два (Lst-HDD) пъти. За да се сравни стафилолитичната активност между протеините, данните се обработват, както следва. За всяка концентрация на протеин беше определено времето, необходимо за намаляване на мътността на суспензията с 50% (време на полу-изчистване) и връзката между концентрацията на протеин и времето на полу-изчистване беше апроксимирана чрез функция на степента. След това тази калибрационна крива се използва за изчисляване на времето за получистване за 50 nM протеин.

3.6. Производство на анти-лизостафинови антитела

3.7. Фармакокинетика